糖尿病胃腸組織微血管中細胞外信號調節激酶磷酸化范文

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【摘要】目的探討糖尿病微小血管病變的發生機制。方法采用免疫組織化學方法，觀察糖尿病和非糖尿病病人胃腸微小血管內皮細胞及平滑肌細胞中細胞外信號調節激酶(ERK1/2)和ets樣基因-1(ELK-1)的磷酸化情況。結果糖尿病組胃腸道組織各層中微小血管內皮細胞磷酸化ERK1/2陽性率明顯高于非糖尿病組(P＜0.05)。糖尿病組胃腸道組織黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層微小血管內皮細胞中，磷酸化ELK-1陽性率分別為91.0%、91.7%、93.6%和65.3%，與非糖尿病組比較(分別為92.7%、91.3%、91.3%和0)，除了漿膜層以外，其余各層差異無統計學意義(P＞0.05)。在糖尿病組，胃腸道組織黏膜層、黏膜下層、肌層、漿膜層微小血管中平滑肌細胞磷酸化ERK1/2陽性率與非糖尿病組差異無統計學意義(P＞0.05)；糖尿病組胃腸道組織各層微小血管平滑肌細胞中磷酸化ELK-1陽性率與非糖尿病組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。糖尿病組內皮細胞中磷酸化ERK1/2與磷酸化ELK-1陽性率正相關(r=0.510，P=0.000)；血管平滑肌細胞中磷酸化ERK1/2與磷酸化ELK-1表達顯示正相關(r=0.386，P=0.000)。結論在糖尿病病人胃腸微小血管中存在ERK1/2信號轉導通路的異常激活。

【關鍵詞】糖尿病；胃；腸；微血管；細胞外調節蛋白激酶；ets樣基因-1

Abstract:ObjectiveToexplorethemechanismofdiabeticmicroangiopathy.MethodsThephosphorylationofextracellularsignal-regulatedkinase(ERK1/2)andetslikegene-1(ELK-1)inthegastrointestinalmicrovascularendothelialcellsandsmoothmusclecellsindiabeticwithnon-diabeticpatientswereobservedwithimmunohistochemistry.Resultsphospho-P44/P42MAPKpositiveexpressioninmicrovascularendothelialcells,thepositiverateofGastrointestinalorganizationslayersindiabeticgroupweresignificantlyhigherthanthatinnon-diabeticgroup(P＜0.05)；Phosphorylation-ELK-1positiveexpressioninmicrovascularendothelialcells,thepositiverateofgastrointestinalmucosa,submucosa,muscularisandserosallayermicrovascularendothelialcellsindiabeticgroupwere91.0%,91.7%,93.6%and65.3%,andinnon-diabeticgroup(respectively92.7%,91.3%,91.3%and0).inadditiontoserosallayer,theremainiylayerswerenosignificantdifferenles(P＞0.05).Indiabeticgroup,phospho-P44/P42MAPKpositiveexpressionrateofgastrointestinalmucosa,submucosa,muscularis,serosallayermicrovascularsmoothmusclecellshadnosignificantdifferencecomparedwiththenon-diabeticgroup(P＞0.05)；Inthediabeticgroup,Phosphorylation-ELK-1positiveexpressionrateofgastrointestinalmucosa,submucosa,muscularis,serosallayermicrovascularsmoothmusclecellshadsignificantdifferencecomparedwiththenon-diabeticgroup(P＜0.05).Inmicrovascularendothelialcells,phospho-P44/P42MAPKandPhosphorylation-ELK-1expressionshowedapositivecorrelation(r=0.510,P=0.000)；Inmicrovascularsmoothmusclecells,phospho-P44/P42MAPKandPhosphorylation-Elk-1expressionshowedapositivecorrelation(r=0.386,P=0.000).ConclusionAbnormalactivationbyphosphorelationofERK1/2signaltransductionpathwaywasprobablyinvolvedinthechangesofgastrointestinalmicrovesselsindiabeticpatients.

Keywords:diabetesmellitus；gastrointestine；Microvessel；extracellularsignal-regulatedkinase1/2；ets-likegene-1

糖尿病微血管病變是多種器官損害的病理生理基礎，是糖尿病致死致殘的主要原因之一。在糖尿病時，可能有多種因素參與微血管病變的形成［1］。近來的研究提示，某些細胞外信號轉導通路的異常變化可能介導了糖尿病微血管病變，絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)，尤其是細胞外調節蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，ERK)可能參于了糖尿病血管并發癥的發生發展［2］。本研究采用免疫組織化學技術，對比研究了糖尿病人胃腸組織微血

管中磷酸化ERK1/2及其下游作用底物磷酸化ets樣基因-1(ets-likegene1，ELK-1)的表達情況。

1材料和方法

1.1標本來源

收集寧夏醫學院附屬醫院2001年4月—2006年12月因為其他疾病進行手術的糖尿病病人胃腸組織標本蠟塊38例(簡稱糖尿病組)，患者年齡38～82歲，平均56歲，男24例，女14例，平均血糖8.7mmol/L;同時收集其他疾病進行手術的非糖尿病病人胃腸蠟塊標本20例(簡稱非糖尿病組)，患者年齡38～83歲，平均59歲，男13例，女7例，平均血糖在正常范圍內。

1.2主要試劑

兔抗人phospho--P44/P42(CellSignaling公司)單克隆抗體，小鼠抗人Phospho-ELK-1(CellSignaling公司)單克隆抗體;鏈霉素親生物素-過氧化酶連接法(streptavidin-peroxidase，S-P)免疫組化檢測試劑盒(Zymed公司產品)；濃縮型DAB試劑盒；多聚賴氨酸防脫片劑，以上試劑購自陜西重信生物技術有限公司

1.3組織病理學觀察

將石蠟包埋的胃腸組織制成5μm切片，HE染色，觀察胃腸組織微小血管的基本情況，胃腸間質炎性細胞浸潤等病變。

1．4免疫組織化學染色

將石蠟包埋的胃腸組織制成厚5μm切片，常規脫蠟至水，3%雙氧水室溫孵育10min以消除內源性過氧化物酶;微波抗原修復；正常山羊血清封閉，室溫下放置15min，傾去血清；兔抗人phospho-P44/P42MAPK單克隆抗體、小鼠抗人Phospho-ELK-1單克隆抗體工作濃度為1∶100稀釋，在濕盒內4℃過夜;生物素標記第二抗體工作液及辣根酶標記的鏈霉素卵白素工作液；DAB室溫下顯色，蘇木素輕度復染；脫水、透明、封片。以PBS代替第一抗體作為陰性對照。

1.5統計學方法

用SPSS12.5統計軟件進行數據統計處理，采用卡方檢驗及秩相關方法分析，以P＜0.05為有統計學意義。

2結果

2．1組織病理學觀察

所有病例的標本胃腸結構完整，包括了黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層，無腫瘤組織和其他明顯病變。糖尿病組與非糖尿病組的胃腸間質有少量淋巴細胞、單核細胞等炎細胞浸潤，特別是黏膜層炎細胞浸潤比較明顯。在各層中血管分布均勻，大多數病例血管結構無明顯異常改變，少數糖尿病組的病例部分血管壁增厚，內皮細胞肥大腫脹。非糖尿病組中的血管壁和內皮細胞無明顯改變。

2．2免疫組化結果

磷酸化ERK1/2、ELK-1陽性為細胞核與細胞漿上棕黃色染色；每張切片分別于黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層隨機采取20個高倍鏡(×40)視野觀察微血管(直徑在100μm以下血管)內皮細胞及平滑肌細胞磷酸化表達，并計數內皮細胞及陽性內皮細胞數、血管平滑肌細胞及陽性血管平滑肌細胞數。

磷酸化ERK1/2主要表達于內皮細胞的細胞核與細胞漿內(圖1，見封2)。糖尿病組胃腸道組織各層中微小血管內皮細胞磷酸化ERK1/2陽性率高于非糖尿病組(P＜0.05)，詳見表1；在糖尿病組，胃腸道組織黏膜層、黏膜下層、肌層、漿膜層微小血管中平滑肌細胞磷酸化ERK1/2陽性率與非糖尿病組比較無統計學意義(P＞0.05)，詳見表2。表1胃腸道組織血管內皮細胞中磷酸化ERK1/2表達結果（略）表2胃腸道組織血管平滑肌細胞中磷酸化ERK1/2表達結果（略）

糖尿病組胃腸道組織黏膜層、黏膜下層、肌層血管內皮細胞中，磷酸化ELK-1陽性率與非糖尿病組比，除了漿膜層以外(圖2，見封2)，其余各層無統計學意義(P＞0.05)，詳見表3；糖尿病組胃腸道組織黏膜層和漿膜層血管平滑肌細胞中磷酸化ELK-1陽性率與非糖尿病組比較，有統計學意義(P＜0.05)，詳見表4。表3胃腸道組織血管內皮細胞中磷酸化ELK-1表達結果（略）表4胃腸道組織血管平滑肌細胞中磷酸化ELK-1表達結果（略）

2.3磷酸化ERK1/2與磷酸化ELK-1表達的相關性

分別對糖尿病組和非糖尿病組胃腸微小血管內皮細胞和平滑肌細胞中磷酸化ERK1/2與磷酸化ELK-1表達進行秩相關分析，內皮細胞中磷酸化ERK1/2與磷酸化ELK-1陽性率正相關(r=0.510，P=0.000)，血管平滑肌細胞中磷酸化ERK1/2與磷酸化ELK-1表達顯示正相關(r=0.386，P=0.000)。

3討論

微血管病變是糖尿病特有的慢性血管并發癥，主要表現為視網膜、腎臟等微血管病變。糖尿病微血管病的表現多樣，早期最突出的病變為微血管內皮細胞功能障礙［3］。由于對某些刺激比大血管內皮細胞更敏感［4］，因此病變出現較早，較廣泛，是糖尿病各種并發癥的發生基礎。糖尿病微血管病變的發生及發展是多因素綜合作用的結果，已有研究顯示，糖尿病狀態下的高糖-蛋白激酶c(PKc)通路［5］、糖基化終產物、氧化應激［6］、生長因子［7］、滲透壓、牽張刺激［8］，還有血管緊張素Ⅱ等都可激活MAPK家族［9］，使轉錄因子活性升高，參與糖尿病微血管病變的發生。本研究顯示糖尿病組胃腸道組織各層中血管內皮細胞磷酸化ERK1/2與其下游作用底物ELK-1表達均明顯增高，提示在糖尿病病人胃腸微小血管中存在ERK1/2信號轉導通路的異常激活。

MAPK是信號轉導途徑之一，細胞外刺激可經G蛋白受體、生長因子受體和酪氨酸蛋白激酶受體，經Raf-MEK-ERK級聯信號激活ERK，調節轉錄因子(如ELK-1、ATF2、C-Myc、STAT等)和一些激酶活性，促進細胞增殖，蛋白質合成［2］。高糖經蛋白質非酶糖化、多元醇通路激活、二酞基甘油-PKC通路及氧化應激等途徑導致ERK1/ERK2的激活，進而磷酸化轉錄因子，調節基因表達，ERK1/ERK2成為高糖所致不同信號通路的交匯點，因此，ERK1/ERK2被視為高糖致糖尿病并發癥的信號傳導子［10］。有研究證明，在高血糖狀態下，葡萄糖激活PKC，PKC經Raf/MEK/ERK級聯信號激活ERK，進而c-J

un和c-Fos蛋白蘇氨酸/酪氨酸殘基磷酸化修飾而激活轉錄因子引起腎小球系膜中各種ECM的產生增多［11］。白蛋白-非酶糖基化終末產物(A1b-AGE)經ERK獨立通路，激活HIF-1，刺激VEGF的表達可能在糖尿病視網膜病變的發展過程中起重要作用［12-13］。Suzuki等［14］發現高糖、AngⅡ使VSMC纖溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)mRNA的表達上調，血漿中PAI-1濃度增高，可通過激活MAPK和PKC通路介導Raf-ERK通路上調而增強FLICE抑制蛋白(FLIP)的活性和促進血管平滑肌細胞的增生［15］。本研究通過組織病理學方法雖然未發現胃腸微血管的明顯病變，但是通過免疫組化證明在糖尿病組胃腸道組織各層中血管內皮細胞磷酸化ERK1/2表達明顯高于非糖尿病組，磷酸化ELK-1表達也明顯高于非糖尿病組，提示在糖尿病胃腸組織中可能已存在微小血管功能障礙。

本實驗證明ERK1/2通路在糖尿病人體胃腸組織微血管中磷酸化表達增強，與在糖尿病動物模型組織微血管中磷酸化的表達趨勢一致。由于糖尿病微血管病變的形成受多種因素的影響，同時ERK1/2信號轉導系統具有非常復雜的作用機制，MAPK在糖尿病微血管病變發生中的具體通路和機制還有待進一步探討。

【參考文獻】

［1］劉聲遠.糖尿病血管病變機制與防治進展［J］.微循環學雜志，2006，16(4)：3-6.

［2］徐勇，黃頌敏.MAPK家族與糖尿病并發癥［J］.國外醫學內分泌學分冊，2001，21(1)：8-10.

［3］HuimingJin，QinhangL，XiangC，etal.Dysfunctionofmicrovascularendothelialcellsinducedbynecrosisfactor(TNFα)：cellularandmolecularmechanism［J］.ClinHemorheol&Microcire,2000，23：109-112.

［4］ZetterBR.Theendothelialcellsoflargeandsmallbloodvessels［J］.Diabetes，1981，30(Suppl2)：24-28.

［5］GlogowshiEA，TsianiE，ZhouX，etal，HighglucosealterstheresponseofmesanialcellproteinkinaseCisoformstoensothlin［J］.KidneyInt，1999，55：486-499.

［6］HaH，KinKH.Pathogenesisofdiabeticnephropathy：theroleofoxidativestressandproteinkinaseC［J］.DiabetesResClinPraet，1999，45：147-151.

［7］FooreeT，BonventreJ.Growthfactorsandmitogenactivatedproteinkinase［J］.Hypertention，1998，31：152-161.

［8］SugkenP，ClerkA.Stressresponsivemitogenactivatedproteinkinaseinmyocardium［J］.CircRes，1998，83：345-352.

［9］NatarajanR，ScottS，BaiW，etal.AngiotensinⅡsignalinginVSMCunderhighglucoseconditions［J

［10］TomlinsonDR.MitogenactiyatedProteinkinasesasglucosetransducersfordiabeticcomplications［J］.Diabetdogia，1999，42：1271-1281.

［11］HanedaM，KoyaD，KikkawaR.Cellularmechanismsinthedevelopmentandprogressionofdiabeticnephropathy：activationoftheDAG-PKC-ERKpathway［J］.AmJKidneyDis，2001，38(4Suppl1)：S178-181.

［12］邵樂平，曲虹，牛膺筠．MAPK家族與糖尿病視網膜病變［J］.臨床眼科雜志，2003，11(05)：478-479.

［13］TreinsC，Giorgetii-PeraldiS，MurdacaJ，etal.Regulationofvascularendothelialgrowthfactorexpressionbyadvancedglycationendproducts［J］.JBiolChem，2001，276(47)：43836-43841.

［14］SuzukiM，AkimotoK，HattoriY.Glucoseupregulatesplasminogenactivatorinhibitor-Igeneexpressioninvascularsmoothmusclecells［J］.LifeSci，2002，72(1)：59-66.

［15］ChenYB，BuddRC，KelmRJ，etal.AugmentationofProliferationofVascularSmoothMuscleCellsbyPlasminogenActivatorInhibitorType1［J］．ArteriosclerThrombVascBiol，2006，26(8)：1777-1783.新晨