糖尿病病證結合動物模型研究進程范文

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摘要:現代醫學研究多借助動物模型了解疾病的發生發展規律及其防治,疾病動物模型的構建也因此取得了長足進步。中醫作為我國的傳統醫學,在考慮疾病本身的同時,更注重病證結合治療,因此構建病證結合動物模型更匹配中醫藥實驗研究。糖尿病腎病(Diabetickidneydisease,DKD)是糖尿病(Dia-betesmellitus,DM)最常見且最嚴重的微血管并發癥,中醫藥對其治療有著較為顯著的臨床療效,因此對其基礎研究就顯得十分必要,構建適合的病證結合動物模型是實驗研究的基本手段。對DKD病證結合動物模型進行了綜述。

關鍵詞:糖尿病腎病;病證結合動物模型;綜述

高達25%~40%的糖尿病(DM)患者合并有糖尿病腎病(DKD),造成了由DKD發展成終末期腎臟疾病的顯著風險,并增加了心血管疾病的發病率和死亡率[1]。現階段,西醫治療DKD多是在合理飲食和運動的基礎上,采用控制血糖、降血壓、調節脂質代謝紊亂等治療方法,但療效不甚明顯。中醫認為DKD可歸屬于“消渴”“水腫”“尿濁”“溺毒”等范疇,辨證施治可取得較好臨床療效。疾病動物模型是現代醫學實驗中不可或缺的研究手段之一,DKD動物模型構建已較為成熟,基于此的中醫病證結合動物模型也有所發展,對中醫治療DKD的方藥、藥理的研究起到了巨大的推動作用。

1DKD疾病動物模型

國內外學者對于DKD動物模型進行了大量的研究,成功構建了許多理想的動物模型。主要分為三大類:一是誘發性DKD模型,通過化學藥物(如鏈脲佐菌素、四氧嘧啶等)誘導、單側或部分腎切除、高糖高脂飲食等手段建模;二是自發性DKD模型,利用其定向培育而保留下來的某些基因突變,在自然狀態下發生DKD,如NOD小鼠、Akita小鼠、db/db小鼠、BB大鼠、OLETF大鼠、GK大鼠等;三是轉基因DKD動物模型,在動物原來遺傳背景的基礎上,通過改變某種基因的表達水平以建立DKD動物模型,如轉基因OVE26小鼠、轉基因(mRn-2e)27大鼠等[2]。后兩類動物模型與人類DKD最為接近,是十分理想的實驗對象,但受獲取難度大、技術要求高、價格昂貴等因素的影響,應用受到了限制;現階段,大多數實驗選用誘發性模型,尤其是鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘導的DKD模型被廣泛應用。STZ是一種高度選擇性胰島β細胞毒性劑,小鼠、大鼠、猴等動物對其毒性作用敏感,但兔對其不敏感,現多用于小鼠和大鼠T1DM模型的制造,其腎臟損害與人類糖尿病腎病相似[3-4]。常用單次大劑量(小鼠≥200mg/kg,SD大鼠55mg/kg,WKY大鼠60mg/kg,SHR大鼠45mg/kg)或多次小劑量(小鼠50~70mg/kg,大鼠30mg/kg)行腹腔注射,有研究顯示多次小劑量給藥的方法造模成功率和穩定性更優[4-7]。此外,動物的遺傳背景、性別、附加處理方式等,對造模也有較大的影響。多次小劑量STZ誘導小鼠的血糖水平順序為DBA/2>C57BL/6>MRL/MP>129/SvEv>BALB/c,DBA/2小鼠的蛋白尿亦最明顯,而SD大鼠成模可能優于Wistar大鼠;采用雄性鼠造模要優于雌性鼠;空腹鼠的成模率要高于非空腹鼠;而單側腎切除合并尾靜脈注射STZ的高血糖情況不如單純腹腔注射STZ,但更符合DKD的病理改變,且節省實驗時間[8-11]。先通過一段時間的高糖高脂飲食誘導出胰島素抵抗,再配合小劑量STZ誘發胰島素分泌障礙,可以制備2型DKD模型;也有在高糖高脂飲食喂養之前或之后,摘除右側腎臟,造成左腎代償性肥大,能提高成模率,縮短成膜時間,且更貼近人類臨床特點[12-13]。

2DKD病證結合模型

目前DKD病證結合模型多采用疾病造模因素與證候造模因素相疊加的方式,在運用一次大劑量STZ或高糖高脂飲食+小劑量STZ的同時,配合證候動物模型的研究成果進行造模。中醫認為DKD的病機總屬本虛標實,患者的本虛證以氣虛、陰虛、陽虛為主要表現,標實證中以血瘀、痰濕為主要表現[14]。近年來,研究者已經構建和使用了氣虛、氣陰兩虛、陽虛、陰陽兩虛、血瘀、氣虛血瘀、陽虛血瘀等多個病證結合模型。

2.1氣虛DKD動物模型

DKD為以虛為本,尤以氣虛最為常見,且始終貫穿于本病的始末。目前報道的氣虛證DKD造模方法有如下2種。朱國茹[15]根據內經“飲食自倍,腸胃乃傷”的理論,用飲食失節(饑餓48h,自由飲食2h)、肥甘過度(普通飼料摻以10%豬油)的方法制造脾氣虛模型,2周成模,然后再一次性以53mg/kgSTZ制造DM模型。申曉光[16]則先通過高糖高脂飲食+小劑量STZ造模之后,依據“勞則氣耗”的理論,將大鼠每天在水溫(37±0.5)℃、深45cm水桶中游泳,待下沉時撈出,并喂以高糖高脂飼料喂養,連續14天后造模成功。這兩種方法都能較好地復制出氣虛證的臨床表現,如精神倦怠萎靡、毛色無光澤、大便異常等。但應該注意疲勞游泳試驗易致大鼠呼衰,含脂量過高的飲食也會加重腎實質進行性損害,從而增加造模死亡率[17],因此造模時要密切關注動物的情況,采取降低游泳強度、提供有氧環境、搭配普通飲食等方式或可提升造模成功率。

2.2氣陰兩虛DKD動物模型

氣陰兩虛是DKD基本病機,病位主要在脾腎,臨床上DKD早期即表現出氣陰兩虛的癥狀。周雪梅等[18]給予DN模型大鼠灌胃耗氣傷陰中藥(青皮、枳殼、附子,組成比為6∶6∶5),劑量達5倍成人等效劑量(3.25g/kg/d),同時應用益氣養陰中藥反證造模成功。高磊[19]連續25天使用甲狀腺素片混懸液10mg/kg/d劑量灌胃,模擬甲亢時出現急躁、多汗、神經過敏、震顫、心率加快等類似于陰虛證候表現,再配合疲勞游泳造模。胡愛民等[20]則是在饑飽失常、疲勞游泳的基礎上,根據“恐傷腎”“恐則氣下”理論,附以驚嚇方式進行氣陰兩虛造模。大鼠一般情況和血漿檢測顯示,怒恐情志刺激可制作肝腎陰虛證模型[21],且情志造模符合中醫七情致病理論,并能排除造模藥物干預對后續的中藥研究的不利影響,要優于前兩種方案。2.3陽虛DKD動物模型DKD病變中期,病情遷延,則陰損及陽。陽虛動物是最早構建的證候動物模型,多采用激素造模。吳朝妍等[22]在大劑量STZ腹腔注射3天后,臀部肌注氫化可的松注射液每只2mL(10mg),連續15天,制作大鼠糖尿病腎陽虛模型,但其死亡率接近20%(9/52)。孫紅旭等[23]用高糖高脂飼料喂養,兩次小劑量(30mg/kg,間隔3天)腹注1周后,再予以腺嘌呤350mg/kg/d加苦寒中藥煎劑(龍膽草、梔子、番瀉葉)4mL/kg/d混合灌服,連續2周,該方法操作較為復雜,且死亡率也不低。這兩種造模方法導致大鼠死亡,可能與藥物的毒副作用引起代謝混亂,加重臟腑衰竭有關,因此還需尋找更合適的造模手段,單獨以苦寒傷陽或許能提示動物存活率,且更具中醫特色。

2.4陰陽兩虛DKD動物模型

陰陽兩虛是DKD晚期的主要證型,但相應病證結合模型卻鮮有報道。郭學軍[24]等在STZ(一次性55mg/kg)腹腔注射制作T1DM模型后,灌服青皮、枳殼、干姜、黃柏復方(配伍比為1∶1∶1∶1),按24g/kg給藥。李慧[25]則采用高糖高脂飲食+小劑量STZ制作T2DM模型后,應用防己、黃柏中藥顆粒劑(配伍比為1∶1),按16.7g/kg給藥,相當于25倍成人用量,運用其性、味的陰陽歸屬不同,過用損傷機體的陰液和陽氣,從而達到造模的目的。兩者所制造的模型均出現腎小球肥大、系膜基質擴張、基底膜增厚等腎臟病理改變,以及陰陽兩虛的表現,并使用金匱腎氣丸進行反證確認。以上兩種造模方式,均先給予STZ刺激構建糖尿病模型,再加以中藥干預構建證候模型,結果顯示較為符合糖尿病腎病陰陽兩虛型,造模較成功。

2.5血瘀DKD動物模型

DKD較少表現出單純的虛證,往往呈現虛實夾雜的狀況;血瘀證作為DKD的主要兼證,貫穿了整個病程的始終。王輝等[26]在一次性大劑量STZ造模成功7周后,皮下注射腎上腺素注射液(0.8mL/kg,2次,間隔4h)模擬暴怒時機體狀態,在注射間隔期間,大鼠浸入冰水5min模擬寒邪侵襲,建立DKD血瘀模型,模型的全血黏度和血漿黏度均明顯升高。也有學者[27-28]發現單純使用高糖高脂飲食+STZ造模的大鼠,也可出現爪掌、尾靜脈的紫暗瘀血,且血脂、血黏度均升高,具備血瘀、痰濁證的特點。高磊[19]則是DN模型制作成功后,采用甲狀腺素+力竭性游泳進行造模,水溫控制在8℃,通過“寒則收引”產生血瘀,持續14天,氣陰兩虛血瘀證造模成功。李海霖等[29]使用真空干燥箱模擬高原地區低壓、缺氧的特點,每天3.5h;再放入冰箱冷藏室中對大鼠進行寒冷刺激3.5h,共35天;在建立證候模型的同時,腹腔一次性注射50mg/kg的STZ,構建高原陽虛血瘀型DKS大鼠模型。根據導致血瘀的主因不同采取不同的干預方式造模,但基于中醫基礎理論均采用了寒冷刺激,且STZ兩者都選用了,進一步說明了STZ在糖尿病腎病造模中的重要性及應用的廣泛性。

3結語

辨證論治是中醫學理論體系的主要特點之一,構建符合中醫學理論的證候動物模型是中醫藥實驗研究中十分關鍵的內容。證候動物模型研究始于上世紀60年代,已有50多年的研究歷程,現已能夠復制百余種證型,覆蓋八綱、六淫、情志、臟腑、氣血津液、六經、衛氣營血辨證等。DKD病證結合模型即是結合疾病動物模型和證候動物模型的造模方法,既擁有其疾病特點,又有符合相應證候特征,保留了病與證的精密關系,有助于更全面、客觀地研究中醫藥防治DKD的作用及其機制。然而,現階段DKD病證結合模型的研究仍然存在很多問題:證候類別偏少,臨床DKD的證候呈現虛實夾雜、復雜多樣的特點,現有的模型過于局限;造模方法不統一,相同證型的可采用多種方式造模,且干預藥物及其劑量也存在著較大差異;評價指標不標準,實驗動物與人的臨床表現不盡相同,套用人的證候表現并不完全合適,同時造模后常多種證候交疊出現,難以明確區分。上述問題影響了DKD病證結合模型的代表性和可信度,致使其應用并不廣泛,當前大多數中醫藥防治DKD的研究使用的仍是DKD疾病動物模型。但相信隨著相關研究的不斷完善,DKD病證結合模型將對中醫藥防治DKD研究作出更大貢獻。

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作者：文雪1；馬躍榮2單位：1.成都中醫藥大學2.成都中醫藥大學附屬醫院/四川省中醫院病理科