食品工業中應用的研究范文

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1傳統方法獲得GOD

1.1菌株誘變對GOD生產菌株的誘變通常采用紫外誘變和化學誘變劑誘變等方法。紫外線照射通過改變菌體DNA從而引起菌體的突變。李筱瑜等人將黑曲霉菌株P－9采用紫外線進行誘變，得到突變菌株U－69產酶酶活是出發菌株P－9的2.5倍?；瘜W誘變是用化學誘變劑處理菌種，以誘發遺傳物質的突變?；瘜W誘變相比于紫外誘變更具定向性，化學誘變劑不同，作用的菌株、細胞及基因不同，誘變的效果也會存在差異。常用的化學誘變劑有甲基磺酸乙酯(EMS)和硫酸二乙酯(DES)等。選擇單獨一種誘變方法，也可以幾種方法復合使用，篩選出其中的正突變菌株，提高原始菌株產酶能力。

1.2微生物產GOD的主要影響因素通過篩選得到高產GOD的天然菌株或者通過誘變育種獲得高產的突變菌株，同時適宜菌株生長的培養條件及合適的培養基組成也是高效生產微生物GOD的關鍵因素。發酵條件的優化能進一步提高菌株的產酶活力。文獻中適宜微生物產GOD的條件見表2。從表2可以看出，不同的菌種對碳源有顯著的選擇性。一般生產中選擇葡萄糖作為產GOD菌株的碳源，Hatziuikolaou等報道，葡萄糖是GOD最主要的誘導物，另有一些霉菌在以蔗糖、糖漿、甘露糖、果糖等作為碳源時也能產生GOD。研究表明，初始碳源濃度為8%左右時適宜GOD的合成。濃度降低，菌體生長緩慢，使產酶下降;而濃度繼續增大，由于其分解代謝物大量生成形成阻遏作用，產酶水平也會降低。而在氮源的選擇上，有研究表明，硝酸鹽比蛋白胨等有機氮源對產酶的促進效果更好。郭曉賢等的研究結果表明，將硝酸鹽和蛋白胨復配作為復合氮源相比于單一氮源更有利于GOD的生成。

培養基初始pH對酶活力有很大的影響，pH值的選擇在GOD的生產中是一個關鍵的因素。GOD在pH56之間活力較高，在接近5.5時酶活力最高;pH值低于4.5，或超過6.5時酶活均有顯著下降趨勢。GOD在強酸強堿環境中活力容易降低的原因可能是由于酶蛋白活性中心氨基酸殘基隨著pH值的變化而發生了改變，使得酶蛋白結構發生變化而喪失活性。在現實環境下，最適pH值不一定是一個固定值，隨著底物、緩沖液的不同而相應地發生變化。一般來說葡萄糖氧化酶在pH56時有較好的穩定性。在微生物的生長和GOD的合成過程中，溫度影響很大，一般認為30℃31℃為黑曲霉的最適發酵溫度。在發酵培養前期將溫度控制在略高于30℃，使菌絲體生長旺盛，之后溫度降至30℃31℃培養，產酶量將有很大程度的增長，因為產酶需要相對較低的溫度。青霉菌生產GOD的適宜溫度比黑曲霉略低，一般在26℃29℃。

產酶活性最初隨時間的增加而增大，達到最大值后隨時間的增加而逐步降低。因為初始階段微生物生長迅速，處于對數生長期，產酶逐漸增加。隨著微生物繼續生長繁殖，代謝產物逐漸增多，尤其是酸的大量生成使pH值迅速下降，不利于產酶。不同菌種生長周期不同，因此根據不同的菌種選擇合適的發酵時間有利于GOD的生產。在菌株培養產酶的過程中，只有當溶氧滿足菌體的需求時，菌體才能正常的生長及產酶。當達到一定轉速，溶氧量已經可滿足菌體生長和產酶的需求時，酶活不會出現明顯增加的現象。在實驗室發酵試驗中，攪拌轉速一般選擇在200r/min左右。在GOD的合成過程中，低濃度的鈣離子對GOD的產生有促進作用，當超過一定濃度之后反而抑制產酶。經試驗發現，以35g/L的濃度添加CaCO3對產酶的促進作用最明顯，而Mg2+、Fe2+在GOD的合成過程中起到抑制作用。

2利用基因重組技術獲得GOD

工業化生產中常用黑曲霉或青霉發酵來獲得GOD，但黑曲霉和青霉菌發酵過程中常會伴隨產生過氧化氫酶、淀粉酶等其他雜蛋白，給后期的分離純化工作帶來困難，使用基因工程菌重組表達葡萄糖氧化酶基因有利于解決這一問題。將GOD的基因進行克隆，連接相應的表達載體后轉化基因工程菌株，通過誘導表達GOD基因來獲取大量的GOD蛋白。由于基因工程菌株分泌到基質中的其本身內源蛋白量很少，基質中主要是基因工程菌株分泌到胞外的外源目的蛋白，因此能簡化后期的蛋白純化操作。目前國外主要用基因克隆、表達來提高菌株的產酶活力，在這一領域研究已經比較深入。WhittingtonH成功地將青霉菌的GOD基因導入到釀酒酵母中，獲得了具有生物活性的GOD;Szynol實現了GOD基因在大腸桿菌中的表達;SilviaCrognale將一株青霉的GOD基因成功導入到畢赤酵母中，發酵培養酶活達到50U/mL;國內在這一方面的研究也取得了一定的進展。母敬郁等采用瑞氏木霉表達了黑曲霉來源的GOD基因，經過對重組后的瑞氏木霉進行誘變篩選，突變株的GOD發酵液酶活達到25U/mL。目前已有多種外源基因表達系統被開發出來，如大腸桿菌表達系統、酵母表達系統等。大腸桿菌表達系統雖然發展較為成熟，操作簡單、周期短、產量高，但其表達產物無翻譯后的修飾與加工過程，不能對蛋白質進行翻譯。酵母繁殖速度快、易于培養、基因工程操作簡便，并能夠對目的蛋白進行翻譯后加工與修飾，越來越廣泛地用作外源基因表達的宿主菌株。常用的酵母表達系統主要有釀酒酵母(Sac-charomycesceresiviae)和巴斯德畢赤酵母(Pichiapasloris)表達系統。釀酒酵母表達系統由于存在表達產物產量低、分泌效果差，不適合高密度發酵等缺點在實際應用中有一定的局限性。巴斯德畢赤酵母表達系統外源基因表達量高且穩定、培養成本低，且適合于高密度發酵，便于實現工業化生產。同時分泌到細胞外的自身蛋白量少，有利于外源蛋白后期的分離純化，因此被廣泛地應用于外源基因的表達。

畢赤酵母發酵生產外源蛋白一般過程包括:首先基因工程菌株在生長培養基中富集培養達到一定的生物量，然后以甲醇為誘導物誘導產酶。前一階段并不誘導產酶，只是菌體富集的階段;后一階段在甲醇的誘導下，畢赤酵母甲醇氧化酶AOX1基因才能啟動和表達，此時才誘導產酶。在優化工程菌株的發酵條件時，除了控制溫度、pH值、溶氧等常規條件外，甲醇作為誘導過程中唯一的碳源和誘導物是影響表達效果的關鍵因素，其誘導方式、濃度、誘導時間都會產生影響外源蛋白的表達。既要保證甲醇濃度能夠滿足畢赤酵母表達代謝所需要的碳源和能量，同時甲醇濃度過高會產生過量的過氧化氫及甲醛，對細胞造成毒害，因此嚴格控制甲醇濃度是提高畢赤酵母表達量的重要因素。雖然目前利用基因工程的手段實現了GOD的異源表達，但是由于表達量不高導致的生產成本高的問題仍然沒有得到有效的解決，阻礙了GOD的大規模工業化生產及應用。因此如何采用基因工程技術實現GOD基因的高效表達，使GOD的產量得到大幅度的提高成為了亟待解決的關鍵問題。

作者：朱運平伍少明李秀婷肖林滕超褚文丹單位：北京工商大學食品學院食品添加劑與配料北京高校工程研究中心北京市食品風味化學重點實驗室山東龍力生物科技股份有限公司