國外生物資源庫建構范文

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作者：方宇寧

溫度之波動

“生物樣本如果不經過適當的處理，其作用就可能受到限制，”馬薩諸塞州劍橋博德研究所的克里斯汀•阿迪利（KristinArdlie）說道。她回憶起一個從胎盤組織樣本分離RNA的項目，由于樣本中含有太多的降解酶，經過多次分離均未能成功。原來研究人員起先將該樣本放在-20℃的冰柜里，幾個小時后再將樣本轉移到符合條件的-80℃的冰柜中。“他們可能認為‘冷凍不就是冷凍嘛’，”阿迪利說道，但一般的冰箱溫度并不足以阻止酶的降解。除了DNA之外，幾乎沒有生物分子能在-20℃的溫度條件下保存完好。大多數樣本可在-80℃的條件保存完好，但某些樣本，如活細胞，必須保存在接近-200℃的溫度條件下。只有在這樣的低溫條件下，酶的所有活動才會完全停止。以不可預知的方式產生變化的分析物比沒有任何分析物更為糟糕。一項研究表明，在對兩個腫瘤標志物樣本進行比較時發現，當場收集的血清與經過冷凍處理并在十年后解凍的血清比較，后者濃度增加了15％左右。在另一項模擬長期冷凍影響的實驗中，研究人員檢測了冷凍后再解凍其血清中多種腫瘤標志物的變化情況，一些蛋白質生物標記在幾十年里，甚至經過多次冷凍解凍，似乎仍然保持穩定不變。然而，血管內皮生長因子———一種與糖尿病、關節炎和癌癥等有關聯的生物標志物，卻是非常的不穩定，不適宜用凍結樣本進行分析。

瑞士生物庫顧問丹尼爾•S-杜巴切（DanielS-Dubach）說道，樣本是否已解凍過用以研究，然后再次保存，這不是所有的生物庫都有記錄的，對冷凍溫度進行監測，也不是所有的生物庫都能做到的。即使是短期的溫度波動，都會使樣本形成破壞性的冰晶。杜巴切曾看到研究人員為炫耀他們的樣本，將冰箱門敝開了好幾分鐘。

冷儲與技術

馬薩諸塞州霍普金頓的漢密爾頓存儲技術公司可容納25萬至1000萬個樣本，在存取樣本時，研究人員不需打開冰柜門，只需將樣本試管放置在冰柜的一個傳遞口處，機械臂會將其移至內部的存儲架上。研究人員甚至可以通過實驗室的信息管理系統尋找所需的某個特定樣本，根據他們的要求，系統進行檢索并將檢索到的樣本存放在傳遞口處，完畢后，系統會通過電子郵件通知研究人員來取。溫度保持在-80℃的冷凍系統還能夠記錄樣本的存取次數，以及使用多長時間。即使不考慮配置這類先進的冷凍設備，冷凍儲存的成本也是十分昂貴的。NCI生物樣本庫的吉姆•沃特（JimVaught）說道，一次典型的流行病學研究項目就有可能產生1萬名患者的10萬份樣本，需要5個冰柜存放，單個冰柜每年正常使用的成本達6000美元。雖然冷凍被認為是保存生物分子和活細胞的最好方式，但其外形卻有可能被破壞。為了降低存儲成本，大多數研究人員采用的是一個多世紀前的保鮮技術：將取自病人的機體組織浸泡在防腐劑福爾馬林中，一些固形組織則嵌放在石蠟塊中。馬里蘭州銀泉聯合病理中心至今保存了2800萬件嵌放在石蠟塊中的樣本，有的樣本可追溯到一戰期間。然而，從石蠟塊中取出一小片組織薄片經染色后在顯微鏡下觀察的方法不能有效保存生物大分子，這些生物組織細胞因缺氧而導致RNA降解，蛋白質發生變化，包括福爾馬林也會致RNA和DNA遭到破壞。當研究人員試圖恢復生物大分子，在去除石蠟時還會造成更多的破壞。雖然從石蠟中可以提取DNA和RNA，但無法保證質量。銷售室溫條件下存放DNA和RNA專用設備的加州IntegenX公司副總裁邁克•霍根（MikeHogan）認為，生物分子退化的原因并非直接源自于福爾馬林，而是因為水解和氧化。冷凍能夠讓樣本長期保存，是因為在較低溫度條件下降解作用變得更加緩慢。IntegenX目前正在改進這方面的技術，旨在去除水分以減緩水解和氧化作用。如果這項技術改良成功，研究人員就能夠利用福爾馬林保存的樣本來研究生物分子。其他的一些改進方法則著重于在樣本使用過程中如何去除福爾馬林。2009年德國Qiagen公司開發的PAXgene系統產品，采用以酒精為基礎的固定劑來保存生物分子，并用石蠟嵌放組織標本。該技術可使生物組織樣本在室溫條件下保存7天，4℃條件下保存4周，-20℃條件下保存幾個月，樣本形態和生物分子都不會受到損害。這種保存方法正在替代深度冷凍。一項規模龐大的組織收集項目中有一個試點項目，其目的是利用以四種不同方式保存的幾十種類型生物組織樣本，進行基因表達和常見的遺傳變異研究。基因型組織表達（GTEx）是美國國立衛生研究院（NIH）進行的一項合作研究項目，參與這一項目的還有選擇PAXgene系統的一些研究所。美國人類基因組研究所項目總監杰弗里•斯特魯威（JeffreyStruewing）解釋道，PAXgene系統不僅能夠保護RNA，還可免除樣本收集過程中超冷保存帶來的運輸上的麻煩。但PAXgene系統長期保存如蛋白質這樣的大分子的效果究竟如何，現在斷言還為時過早。“沒有任何一種保存方法能夠適用于所有樣本或所有分析物的。”

樣本之收集

一些最棘手的困難在樣本保存之前就已經存在了。NCI所轄的生物樣本庫和生物樣本研究辦公室(OBBR)負責人卡羅琳•康普頓（CarolynCompton）說道：“生物標本是人體的一部分，從體內分離時經歷了前所未有的壓力。”當血液供應被切斷，并暴露在突然變化的溫度條件下時，細胞的行為就變得很難預料。基因表達和蛋白磷酸化發生大幅度的變化，有可能激活細胞的自毀行為。康普頓指出，研究人員必須要弄明白，樣本分析結果是否真實反映了來自患者的生物學狀況，“在進行一次堪稱完美的檢測之后，得到的卻有可能是錯誤的結果。”

即使組織保存完好，仍有可能不能反映真實的生物學狀況。“問題不僅僅是樣本收集后的時間保存間隔，”休伊特說道，“而是樣本在收集時已經缺乏活力。”從戴呼吸器患者身上收集到的與不戴呼吸器收集到的組織樣本可能會有所不同，“如果在我劃船后進行手臂肌肉活檢，我的RNA信息與休息后進行的活檢其結果也會有很大的區別。”非住院志愿者的血液、尿液和唾液樣本可以在預定點收集，但是固形組織樣本通常是在醫院急診手術中收集到的，去除藥物、麻醉藥劑和血液殘余的過程都會對樣本質量產生影響。另外，樣本冷凍之前在室溫下停留時間的長短，使用固定液的類型，以及冷凍過程的快慢等都會影響樣本保存的質量。在OBBR于今年二月舉辦的一次會議上，奧馬哈市內布拉斯加衛理公會醫院病理學家吉恩•赫伯克（GeneHerbek）講述了與外科醫療團隊的合作經驗，即保證組織樣本在切除后的一小時內送達病理學家的實驗室里。德國漢堡的一家生物技術公司可以在組織切除后的10分鐘內進行樣本收集，并由指定的護士與手術組一起進行術前準備工作，機體組織一旦被切除，即刻被送到隔壁專門的房間進行切片固定和冷凍處理。“一般來說，從獲取樣本到開始處理的最佳時間在15分鐘之內，”杜巴切說道。具體到不同器官是有所不同的，例如胃等胃腸器官的處理必須更快。驗尸過程中收集組織樣本的速度也很重要，收集人員要做好隨時接收捐贈器官的準備。半數以上的組織樣本可于死亡后6小時內收集和進行處理。當組織樣本被送到參與GTEx計劃一方的博德研究所，在開始分析之前，阿迪利的研究團隊會先將RNA分離出來，并以RNA質量完整性指數RIN（RNAintegritynumber）對樣本進行質與量的檢測，雖然這稱不上是一種非常完善的措施，但至少可以將一些完整性極差的樣本排除在外。

評估與規范

許多生物庫專家發現，在分析中研究人員對樣本品質問題較少考慮。2004年至2009年間發表在開放式獲取期刊上的125篇關于生物標記物的論文，半數以上都沒有提及樣本獲取、保存和處理的相關信息。這種情況也許并不奇怪，生物庫模式的樣本收集、保存和處理只是在近年才出現。OBBR成立于2005年，2007年首次了樣本收集最佳方法的有關規定，并于去年了提高研究質量的生物樣本報告。美國國際生物資源和環境保護學會于2005年首次出版了樣本收集的最佳做法，并于2010年了樣本預分析標準規范（StandardPRE-analyticalCode），詳細描述了樣本組織的收集范圍以及收集方法。歐盟也資助了一項被稱為“通用預分析工具和體外診斷程序的標準化和改進”四年計劃。這是一項由多機構參與的項目，由Qiagen公司居中協調，其目的是改進和規范體外診斷的樣本處理。對此，沃特認為，公布的這類準則都是根據研究人員的印象和經驗，并非是保存樣本的最好方式。專業人員往往經過多次研究后形成了他們自己的一些做法，但沒有正式公布出來。“目前并不存在建立在扎實研究為基礎的統一國際標準。”事實上，用于研究和維護生物樣本質量的資源極為短缺，“人們希望有足夠的資金用于研究項目和分析，而不是支持它的基礎設施，”康普頓說道。僅保存50000件樣本第一年的啟動成本就在300萬至500萬美元之間，這還不包括信息系統在內，為期十年的運營成本可能在1000萬美元以上，這對于維持樣本庫的日常開支是一個極大的挑戰。

發展與前景

目前，有一些組織專門幫助研究人員獲取其所需的樣本，例如，人體組織合作網絡（旨在改善獲得人體組織的途徑）是由NCI發起的一個橫跨美國各地的網絡，它要求研究人員從常規的外科手術和尸體解剖過程中獲取組織和組織液。又如，賓夕法尼亞州費城的美國疾病研究交流中心專門收集較罕有的標本，眼睛等。其他一些國家也開始發起大型生物庫項目計劃（見“鏈接：英國生物銀行介紹”）。泛歐洲生物樣本庫和生物分子資源研究平臺（BBMRI）是歐洲各生物庫形成的一個網絡，其宗旨是讓研究人員能夠共享人體組織樣本和數據。包括加拿大魁北克省的基因組學公共人口項目（P3G），不僅提供樣品收集和處理等方面的開源軟件，同時也擁有自己的生物樣本數據庫。P3G研發主任、麥吉爾大學健康中心的伊莎貝爾•福捷（Is-abelFortier）認為，一項研究，甚至一個大的研究項目，都不可能擁有足夠的樣本。“對于已經收集到的數據，我們要賦予它們第二次生命。”

有關樣本的信息越多，對其他研究人員的價值也更大。比如，研究某種與癌癥有關特定基因的科學家，如果擁有大量可供研究的腫瘤樣本，就可以省去很多時間并節省大量的經費。輝瑞藥物公司高級副總裁、BBMRI科學顧問戴維•考克斯（DavidCox）認為，充分利用生物標本的方式是一種重新利用研究人員為他們自己的研究目的而收集樣本的途徑。“你不可能儲存所有的樣本或獲得所有的樣本，并將它們一一保存起來，這樣的想法代價昂貴，而且很難保持質量。”與每個樣本收集部門分別商談樣本的利用問題也是一種低效率的做法。他設想了一種松散協調的“卓越中心”模式：研究人員可存儲樣本，跟蹤與自己研究方向有關的臨床資料，同時也為共享和保證樣本的質量作出自己的貢獻。考克斯說道，生物庫的問題之一是如何建設？

誰來買單？“有些人的目的是想利用某些生物樣本獲取利益，而不是建設一個龐大的生物庫。”政府資金偏緊，制藥公司只愿意資助能產生新產品的研究，而個人捐贈標本一般出于公眾利益的考慮，而不是企業利潤。需要有一種方式將生物庫基礎設施和相關信息“以競爭前模式結合起來，這樣我們就可以對生物學有更好的了解，同時也能開發出更好的藥物，”考克斯說道。對于生物庫的建設來說，最困難的問題也許還是資金問題。