細(xì)胞層面顯微鏡的運(yùn)用范文

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1原子力顯微鏡簡(jiǎn)介

最初的AFM是在一個(gè)彈性懸臂上固定一個(gè)尖端極細(xì)的探針在樣品表面掃描。探針針尖上的原子與樣本表面的原子之間存在一定的斥力，掃描時(shí)針尖隨樣本表面的高低起伏變化，使懸臂隨之上下起伏，用一束激光照到懸臂上，其上下起伏可由激光束的變化反射到接收裝置中，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后形成樣品表面的三維形貌圖。根據(jù)針尖與樣本的接觸情況，AFM有兩種掃描模式：接觸模式與輕敲模式，前者指針尖在掃描過(guò)程中始終與樣品接觸，后者則是利用懸臂的高頻震動(dòng)使針尖間斷地與樣品接觸。AFM的成像原理使它具有其他顯微技術(shù)所不具備的優(yōu)點(diǎn)：1)分辨率高；2)觀察的樣品范圍很廣；3)制樣簡(jiǎn)單；4)可在液態(tài)環(huán)境中觀察；5)成像時(shí)間短，可得到物體表面的三維形貌圖。在醫(yī)學(xué)診斷中，AFM能夠觀察到細(xì)胞膜原子量級(jí)的變化，這對(duì)于疑難病例的進(jìn)一步診斷與研究，可以起到很大的輔助作用，在人體的各個(gè)系統(tǒng)中，相關(guān)學(xué)科研究者先后應(yīng)用原子力顯微鏡進(jìn)行了大量的觀察分析。

2原子力顯微鏡在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

2.1心血管系統(tǒng)

早期，LalR對(duì)于心臟的縫隙連接，DomkeJ對(duì)單個(gè)心肌細(xì)胞的機(jī)械脈沖這些心肌細(xì)胞間的微細(xì)結(jié)構(gòu)都進(jìn)行了觀察。Davies等，Miyazaki等較早利用AFM對(duì)兔腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的觀察，在一個(gè)側(cè)面反映了內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)特性。而Sato等[3]應(yīng)用AFM測(cè)量靜息培養(yǎng)及剪切應(yīng)力作用下的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的局部力學(xué)特征。近年來(lái)，Wildling等[4]應(yīng)用AFM測(cè)量培養(yǎng)的人類對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926表面和醛固酮化的AFM針尖之間的剪切力和粘附性，得出結(jié)論是血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面存在醛固酮受體。而Jacot等[5]的研究中關(guān)注了基板僵硬在心肌細(xì)胞成熟中的影響。發(fā)現(xiàn)，心外膜的彈性模量自胚胎期的(12±4)kPa到新生兒期的(39±7)kPa。這種變化從一定程度上說(shuō)明了顯著影響新生兒心肌發(fā)展的因素。

2.2消化系統(tǒng)

雖然掃描電鏡和透射電鏡可以顯示完整的細(xì)胞骨架及孔的輪廓，但是AFM卻可以對(duì)肝內(nèi)皮細(xì)胞竇孔進(jìn)行觀察，AFM可顯示竇孔為抬高的嵴，間接反映出管性細(xì)胞骨架[6]。Braet等[7]用AFM觀察到肝臟的自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)和CC531s大腸癌細(xì)胞在共同培養(yǎng)基中相互結(jié)合后，CC531s大腸癌細(xì)胞的數(shù)量減少，這為臨床治療提供了思路，可以嘗試導(dǎo)入NK細(xì)胞來(lái)殺傷癌細(xì)胞。

2.3呼吸系統(tǒng)

在氣體交換過(guò)程中，肺泡表面活性物質(zhì)(TM)可以調(diào)節(jié)肺泡的表面張力，從而保持肺結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。TM由40nm×40nm的正方形拉長(zhǎng)的蛋白質(zhì)脂蛋白組成，早在1999年Nag等[8]就應(yīng)用AFM聯(lián)合TEM對(duì)TM進(jìn)行了研究。侯淑蓮等利用AFM對(duì)產(chǎn)生了TM的特殊三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察。

2.4神經(jīng)系統(tǒng)

Annalisa等較早的利用AFM比較了人的正常神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)腫瘤細(xì)胞表面的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并觀察到了神經(jīng)元突起，Ohshiro等[9]將神經(jīng)軸突和RBL間的信息傳遞在AFM上進(jìn)行了成像。應(yīng)用力學(xué)方面，使用彈性常數(shù)為0.03N/m的微懸臂，當(dāng)諧振頻率為30kHz時(shí)，對(duì)多種活細(xì)胞如大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等進(jìn)行了成像研究，在細(xì)胞培養(yǎng)液中可獲得高分辨的活細(xì)胞表面形貌信息[10-11]。劉智良等[12]在實(shí)驗(yàn)中，利用AFM觀察和測(cè)定到了紅藻氨酸作用后海馬神經(jīng)元胞膜表面超微結(jié)構(gòu)明顯變化。刑仕歌等研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的Ach可損傷神經(jīng)細(xì)胞膜，降低細(xì)胞存活率，損傷程度有時(shí)間和劑量依賴性。陳勇等對(duì)培養(yǎng)的PC12神經(jīng)元細(xì)胞從形態(tài)學(xué)方面探究，應(yīng)用AFM可以觀察到其凋亡小體的膜表面發(fā)生了明顯的變化。對(duì)于不同來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞，周虎田等[13]應(yīng)用原子力顯微鏡觀測(cè)到細(xì)胞表面形貌結(jié)構(gòu)的異同：更深入揭示了不同來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化差異的機(jī)制。Cecchi等[14]利用AFM在接觸模式下，就人類SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤中ADDLs對(duì)膜脂質(zhì)過(guò)量和膽固醇含量的依賴性進(jìn)行了調(diào)查研究。

2.5血液系統(tǒng)

使用AFM對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞活化48h內(nèi)的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行的研究[15]表明：淋巴細(xì)胞在受刺激后形貌發(fā)生明顯變化，同時(shí)細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)也趨復(fù)雜，出現(xiàn)免疫突觸。劉美莉等[16]利用AFM和SNOM分別進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞表面分布著凹凸不平的顆粒狀結(jié)構(gòu)，可以更深入的了解免疫信號(hào)的傳遞、淋巴細(xì)胞的活化、闡明免疫過(guò)程的作用機(jī)制。蔡小芳[17]通過(guò)AFM力曲線的分析發(fā)現(xiàn)正常淋巴細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞的力學(xué)性能有著明顯區(qū)別。說(shuō)明原子力顯微鏡以其分子力譜的優(yōu)勢(shì)可能可以應(yīng)用于臨床區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。胡怡等[18]利用原子力顯微鏡從可視化的角度觀察人血小板與Ⅰ型膠原膜相互作用后受激活化過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化。

2.6泌尿生殖系統(tǒng)

利用AFM觀測(cè)膀胱癌病人BIU-87活細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，顯示了單個(gè)癌細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，細(xì)胞間的連接，通過(guò)胞膜伸出的突觸。之后又對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株T24活細(xì)胞進(jìn)行了動(dòng)態(tài)成像觀察。

2.7眼科

用AFM研究正常兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞，獲得了內(nèi)皮細(xì)胞表面及覆蓋于表面的糖鏈圖像，并將戊二醛固定標(biāo)本的結(jié)晶與剛摘除的新鮮標(biāo)本的結(jié)晶相比較，同時(shí)用唾液酸酐酶及透明質(zhì)酸酶處理樣品后還獲取了糖鏈組成的信息。實(shí)驗(yàn)證明：透明質(zhì)酸酶處理的標(biāo)本較唾液酸酐酶處理標(biāo)本細(xì)胞表面及形態(tài)變化較少，更接近于固定的未處理的內(nèi)皮細(xì)胞真實(shí)形態(tài)。

2.8口腔科

AFM在牙科生物材料的研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。Hegedus等[21]對(duì)牙釉質(zhì)表面進(jìn)行侵蝕方面的觀察實(shí)驗(yàn)。Marshall[22]，Wennerberg等[23]用AFM成像觀察了Carisolv處理齲齒前后表面的變化，肯定了Carisolv的治療價(jià)值。Arzate等較早利用AFM觀察比較了人的牙骨質(zhì)癌細(xì)胞和造骨細(xì)胞不同的形貌特征；李鑫輝等將原子力顯微技術(shù)引入到口腔腫瘤病理學(xué)的研究中。除了獲得高分辨率的癌細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)成像之外，還對(duì)樣品表面進(jìn)行了局部操縱。

2.9腫瘤細(xì)胞的觀察

應(yīng)用AFM觀察腫瘤細(xì)胞，利用所測(cè)得的形貌圖和相圖將觀察到的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行比較，可以直觀的獲得細(xì)胞的異同，為探究腫瘤疾病的病因及發(fā)生機(jī)制開辟了新途徑。早期，Ehrenhoefer等對(duì)MDCK細(xì)胞、WuHW等對(duì)L929細(xì)胞、Goldmann等對(duì)F9細(xì)胞、Rotsch等[24]對(duì)腺癌細(xì)胞的觀察，發(fā)現(xiàn)各類細(xì)胞的細(xì)胞膜表面均有高度不等的“突起”和“凹陷”；不同種類的細(xì)胞“突起”和“凹陷”不同，表現(xiàn)出明顯的差異。陳勇等[25]對(duì)培養(yǎng)的人胃癌SGC7901、人肝癌HepG2、人肺癌細(xì)胞AF2TC2A21、人乳腺癌MCF272R和人肺腺癌A549細(xì)胞經(jīng)藥物作用后，進(jìn)行細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)的觀察，對(duì)于相關(guān)腫瘤細(xì)胞的特性有了更直觀的了解。近期，Kaul-Ghanekar等[26]發(fā)現(xiàn)相對(duì)與正常相臨近的組織切片，SMAR1表達(dá)減低的人類乳腺癌組織切片的表面粗糙度增高。王希濤等[27]應(yīng)用AFM觀察了S100A8/A9處理后的人宮頸癌上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CasKi細(xì)胞，細(xì)胞形貌發(fā)生卷曲，皺縮，細(xì)胞膜下的骨架結(jié)構(gòu)比較模糊，排列紊亂，網(wǎng)絡(luò)狀的結(jié)構(gòu)遭到了破壞，細(xì)胞間連接和偽足減少。從而證實(shí)了S100A8/A9蛋白復(fù)合物對(duì)細(xì)胞骨架的影響是通過(guò)改變F-肌動(dòng)蛋白的解聚和重排發(fā)生作用的。

3展望

AFM在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，制約因素主要有：首先，細(xì)胞純度的提取，單細(xì)胞的獲得。由于在各個(gè)器官組織中存在多種細(xì)胞，而且取得的玻片標(biāo)本中，細(xì)胞厚度均勻不一，無(wú)法清楚的獲得AFM掃描圖像，甚至無(wú)法順利進(jìn)行掃描，而培養(yǎng)的細(xì)胞和原生的細(xì)胞存在很大差異。其次，普遍研究的是經(jīng)過(guò)溶液固定的細(xì)胞和組織，以至于處理后的細(xì)胞活性大大降低，因此主要的研究熱點(diǎn)轉(zhuǎn)為利用AFM在生理?xiàng)l件下對(duì)新鮮組織和活性的細(xì)胞進(jìn)行高分辨成像。但是，能夠在生理?xiàng)l件下，使用AFM對(duì)活體生物樣本進(jìn)行高分辨成像的細(xì)胞種類還不多，成像質(zhì)量也有待提高。所以，探索一個(gè)更適合的單細(xì)胞取材方法，開發(fā)在生理狀態(tài)下對(duì)活性細(xì)胞的探測(cè)手段，擴(kuò)展原子力顯微鏡的觀察范圍，將為AFM在各學(xué)科中的應(yīng)用開辟更大的空間。