鼻腔鼻竇鱗狀癌細(xì)胞研究范文

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［摘要］目的探討促肝細(xì)胞再生磷酸酶－3（PRL－3）在鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌（SNSCC）中表達(dá)的臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)及逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT－PCR）方法檢測(cè)62例SNSCC組織（SNSCC組）中PRL－3蛋白的表達(dá)水平，并對(duì)30例鼻息肉患者（NP組），以及25例正常鼻腔黏膜（對(duì)照組）做相同蛋白表達(dá)并進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果在蛋白水平和基因水平檢測(cè)，均發(fā)現(xiàn)SNSCC組中PRL－3的表達(dá)高于NP組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。PRL－3的表達(dá)情況在不同的性別、年齡中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），而隨著TNM分期的增高，分化程度的降低及合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，PRL－3的表達(dá)明顯增高（P＜0．05）。結(jié)論P(yáng)RL－3的表達(dá)可以對(duì)SNSCC的增殖活性作很好的參照，表達(dá)強(qiáng)度可明顯反映SNSCC細(xì)胞增殖活性，PRL－3可能是SNSCC的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，提示預(yù)后不良。

［關(guān)鍵詞］鼻腔；鼻竇；癌，鱗狀細(xì)胞；促肝細(xì)胞再生磷酸酶－3

促肝細(xì)胞再生磷酸酶－3（PRL－3）屬于酪氨酸蛋白磷酸酶，它是目前發(fā)現(xiàn)的與惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)的一個(gè)重要基因，它可以促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖黏附及遷移［1］。目前，鮮見PRL－3在鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌（SNSCC）中的表達(dá)及意義的報(bào)道，其與SNSCC的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系尚待研究。本研究就采用免疫組織化學(xué)及逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT－PCR）的方法檢測(cè)PRL－3在SNSCC中的表達(dá)情況，分析PRL－3與SNSCC臨床病理特征的關(guān)系，探討PRL－3與SNSCC分化、轉(zhuǎn)移及預(yù)后之間的關(guān)系，為臨床早期診斷SNSCC提供參考。

1資料與方法

1．1一般資料

收集本院2007年12月至2014年12月手術(shù)切除或活檢的62例SNSCC組織（SNSCC組），30例鼻息肉（NP組）和25例接受中鼻甲部分切除術(shù)患者的切除中鼻甲黏膜組織（對(duì)照組）。其中，SNSCC組男39例，女23例，年齡32～77歲；NP組男19例，女11例，年齡16～70歲；對(duì)照組男13例，女12例，年齡18～53歲。SNSCC組均未接受任何的放化療或免疫治療。所有標(biāo)本取材后平分為兩份，一份送病理科做成石蠟塊，另一份放入液氮中冰凍保存。

1．2方法

1．2．1主要試劑

鼠抗人PRL－3單克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司；羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）／辣根酶標(biāo)記二抗和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司；PCR引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；50bpDNALadder購自北京天根生化有限公司。

1．2．2免疫組織化學(xué)（SP法）檢測(cè)PRL－3的表達(dá)

取包埋石蠟塊、4μm連續(xù)切片。按SP法試劑盒操作規(guī)程說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，切片常規(guī)脫蠟、水化，進(jìn)行抗原修復(fù)，經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染后，脫水、封片。用已知陽性標(biāo)本陽性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗做陰性對(duì)照。結(jié)果判定：PRL－3陽性表達(dá)為在細(xì)胞膜及膜周細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，每張切片取5～8個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察，每個(gè)視野的細(xì)胞計(jì)數(shù)為100個(gè)，取平均數(shù)，根據(jù)陽性細(xì)胞百分比來對(duì)PRL－3陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行判斷，≤25％為（－），＞25％～＜51％為（＋），51％～75％為（＋＋），＞75％為（＋＋＋）。

1．2．3RT－PCR法檢測(cè)PRL－3的表達(dá)

凍存的SNSCC標(biāo)本按Trizol一步法，提取總RNA，將2μg總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA產(chǎn)物為模板，PRL－3和GAPDH為引物，行PCR擴(kuò)增。根據(jù)已知PRL－3基因序列，上游引物序列：5′－GGGACTTCTCAGGTCGTGTC－3′，下游引物序列5′－AGCCCCGTACTTCTTCAGGT－3′。β－actin上游引物序列5′－AGCGAGCATCCCCCAAAGTT－3′，下游引物序列5′－GGGCACGAAGGCTCATCATT－3′。嚴(yán)格按照熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，熒光定量PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，63℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)。72℃終延伸10min，取PCR產(chǎn)物行質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％瓊脂糖凝膠電泳分析，經(jīng)溴化乙錠顯影后，凝膠成像系統(tǒng)成像，并進(jìn)行光密度半定量分析。目的基因的相對(duì)表達(dá)量以目的條帶積分光密度（OD）值與內(nèi)參照條帶OD值的比值表示。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13．0進(jìn)行描述分析，計(jì)量資料用x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間采用χ2檢驗(yàn)（必要時(shí)用Fisher精確法）等級(jí)資料兩組間比較用Wilc－oxon秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1PRL－3蛋白在3組患者標(biāo)本組織中的表達(dá)情況

PRL－3蛋白在SNSCC組（75．81％）中的表達(dá)顯著高于在對(duì)照組（20．00％）及NP組（40．00％）中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

2．2PRL－3蛋白在SNSCC組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

PRL－3蛋白在SNSCC中的表達(dá)與病理分期、分化程度及合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0．05），與性別、年齡無關(guān)（P＞0．05）。

2．3RT－PCR法檢測(cè)PRL－3蛋白在3組組織中的表達(dá)

SNSCC組中的PRL－3mRNA相對(duì)表達(dá)量（0．89±0．09）明顯高于NP組（0．57±0．06）及對(duì)照組（0．21±0．02）（P＜0．05）。RT－PCR反應(yīng)后電泳結(jié)果。

3討論

PRLs屬于一類酪氨酸蛋白磷酸酶，其家族包含3個(gè)亞型，即PRL－1、PRL－2和PRL－3。而其中以PRL－3在腫瘤中的生物活性最顯著。PRL－3位于染色體8q24．3上，含有PTP催化位點(diǎn)序列，其編碼蛋白產(chǎn)物含有一個(gè)保守的C－末端半胱氨酸CAAX殘基－異戊烯化結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域內(nèi)的Cys104和Arg110保守催化殘基與PRL－3的酶活性有關(guān)。PRL－3蛋白在人的骨骼肌、胰腺組織及心肌細(xì)胞中有不同程度的表達(dá)，而腦肺肝腎等組織鮮有表達(dá)。它具有促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖，增強(qiáng)惡性細(xì)胞遷移和浸潤能力，還有促進(jìn)細(xì)胞惡化及轉(zhuǎn)移等多種功能［4－7］，具體作用機(jī)制包括以下幾點(diǎn)：（1）PRL－3可通過激活Rho信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和活動(dòng)性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移；（2）PRL－3可通過介導(dǎo)ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)腫瘤血管的生成，從而促進(jìn)腫瘤的生長及成熟，促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（3）PRL－3可通過誘導(dǎo)促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體的過度表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移；（4）PRL－3還可通過調(diào)節(jié)其他癌癥相關(guān)基因的表達(dá)來介導(dǎo)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移；（5）PRL－3通過正調(diào)控PI3K細(xì)胞通路，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分裂增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長。此外，PRL－3還可通過調(diào)節(jié)PI3K通路促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移；（6）PRL－3可促進(jìn)轉(zhuǎn)移性腫瘤的形成。

本研究顯示，SNSCC組織中的PRL－3的表達(dá)明顯高于NP組織及正常鼻腔黏膜組織，而且與SNSCC的TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此結(jié)果提示在SNSCC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中PRL－3可能發(fā)揮了重要的作用。因此，檢測(cè)PRL－3可能對(duì)早期發(fā)現(xiàn)SNSCC具有重要的臨床意義，同時(shí)，對(duì)SNSCC生物學(xué)行為、預(yù)后具有重要意義，有可能成為SNSCC治療的靶點(diǎn)及預(yù)后標(biāo)記物。本研究對(duì)PRL－3高表達(dá)與SNSCC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系在分子水平上提供了一些理論基礎(chǔ)，但其具體作用機(jī)制，尤其是PRL－3通過何途徑促進(jìn)SNSCC轉(zhuǎn)移的，仍需進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)

［1］孫振華，卜平．胃癌PRL－3與Bmi－1mRNA聯(lián)合表達(dá)的定量分析及其意義［J］．廣東醫(yī)學(xué)，2012，33（7）：987－989．

［2］郭延林，朱彥君，伍青．PRL的生物學(xué)功能及與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展［J］．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2013，21（3）：659－662．

作者：陸鴻略1，馬桂琴1，岳卓立1，康菲2 單位：承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1．耳鼻咽喉科；2．體檢科