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鼻腔鼻竇鱗狀癌細(xì)胞研究范文

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鼻腔鼻竇鱗狀癌細(xì)胞研究

[摘要]目的探討促肝細(xì)胞再生磷酸酶-3(PRL-3)在鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌(SNSCC)中表達(dá)的臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)及逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法檢測62例SNSCC組織(SNSCC組)中PRL-3蛋白的表達(dá)水平,并對30例鼻息肉患者(NP組),以及25例正常鼻腔黏膜(對照組)做相同蛋白表達(dá)并進(jìn)行對比。結(jié)果在蛋白水平和基因水平檢測,均發(fā)現(xiàn)SNSCC組中PRL-3的表達(dá)高于NP組及對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PRL-3的表達(dá)情況在不同的性別、年齡中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而隨著TNM分期的增高,分化程度的降低及合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,PRL-3的表達(dá)明顯增高(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)RL-3的表達(dá)可以對SNSCC的增殖活性作很好的參照,表達(dá)強(qiáng)度可明顯反映SNSCC細(xì)胞增殖活性,PRL-3可能是SNSCC的一個獨(dú)立預(yù)后指標(biāo),提示預(yù)后不良。

[關(guān)鍵詞]鼻腔;鼻竇;癌,鱗狀細(xì)胞;促肝細(xì)胞再生磷酸酶-3

促肝細(xì)胞再生磷酸酶-3(PRL-3)屬于酪氨酸蛋白磷酸酶,它是目前發(fā)現(xiàn)的與惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)的一個重要基因,它可以促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖黏附及遷移[1]。目前,鮮見PRL-3在鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌(SNSCC)中的表達(dá)及意義的報(bào)道,其與SNSCC的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系尚待研究。本研究就采用免疫組織化學(xué)及逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)的方法檢測PRL-3在SNSCC中的表達(dá)情況,分析PRL-3與SNSCC臨床病理特征的關(guān)系,探討PRL-3與SNSCC分化、轉(zhuǎn)移及預(yù)后之間的關(guān)系,為臨床早期診斷SNSCC提供參考。

1資料與方法

1.1一般資料

收集本院2007年12月至2014年12月手術(shù)切除或活檢的62例SNSCC組織(SNSCC組),30例鼻息肉(NP組)和25例接受中鼻甲部分切除術(shù)患者的切除中鼻甲黏膜組織(對照組)。其中,SNSCC組男39例,女23例,年齡32~77歲;NP組男19例,女11例,年齡16~70歲;對照組男13例,女12例,年齡18~53歲。SNSCC組均未接受任何的放化療或免疫治療。所有標(biāo)本取材后平分為兩份,一份送病理科做成石蠟塊,另一份放入液氮中冰凍保存。

1.2方法

1.2.1主要試劑

鼠抗人PRL-3單克隆抗體,購自武漢博士德生物工程有限公司;羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)/辣根酶標(biāo)記二抗和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司;PCR引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;50bpDNALadder購自北京天根生化有限公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)(SP法)檢測PRL-3的表達(dá)

取包埋石蠟塊、4μm連續(xù)切片。按SP法試劑盒操作規(guī)程說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,切片常規(guī)脫蠟、水化,進(jìn)行抗原修復(fù),經(jīng)DAB顯色,蘇木素復(fù)染后,脫水、封片。用已知陽性標(biāo)本陽性對照,磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照。結(jié)果判定:PRL-3陽性表達(dá)為在細(xì)胞膜及膜周細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒,每張切片取5~8個高倍視野進(jìn)行觀察,每個視野的細(xì)胞計(jì)數(shù)為100個,取平均數(shù),根據(jù)陽性細(xì)胞百分比來對PRL-3陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行判斷,≤25%為(-),>25%~<51%為(+),51%~75%為(++),>75%為(+++)。

1.2.3RT-PCR法檢測PRL-3的表達(dá)

凍存的SNSCC標(biāo)本按Trizol一步法,提取總RNA,將2μg總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA產(chǎn)物為模板,PRL-3和GAPDH為引物,行PCR擴(kuò)增。根據(jù)已知PRL-3基因序列,上游引物序列:5′-GGGACTTCTCAGGTCGTGTC-3′,下游引物序列5′-AGCCCCGTACTTCTTCAGGT-3′。β-actin上游引物序列5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′,下游引物序列5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。嚴(yán)格按照熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作,熒光定量PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,63℃退火1min,72℃延伸1min,35個循環(huán)。72℃終延伸10min,取PCR產(chǎn)物行質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,經(jīng)溴化乙錠顯影后,凝膠成像系統(tǒng)成像,并進(jìn)行光密度半定量分析。目的基因的相對表達(dá)量以目的條帶積分光密度(OD)值與內(nèi)參照條帶OD值的比值表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0進(jìn)行描述分析,計(jì)量資料用x±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示,組間采用χ2檢驗(yàn)(必要時(shí)用Fisher精確法)等級資料兩組間比較用Wilc-oxon秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PRL-3蛋白在3組患者標(biāo)本組織中的表達(dá)情況

PRL-3蛋白在SNSCC組(75.81%)中的表達(dá)顯著高于在對照組(20.00%)及NP組(40.00%)中的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2PRL-3蛋白在SNSCC組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

PRL-3蛋白在SNSCC中的表達(dá)與病理分期、分化程度及合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),與性別、年齡無關(guān)(P>0.05)。

2.3RT-PCR法檢測PRL-3蛋白在3組組織中的表達(dá)

SNSCC組中的PRL-3mRNA相對表達(dá)量(0.89±0.09)明顯高于NP組(0.57±0.06)及對照組(0.21±0.02)(P<0.05)。RT-PCR反應(yīng)后電泳結(jié)果。

3討論

PRLs屬于一類酪氨酸蛋白磷酸酶,其家族包含3個亞型,即PRL-1、PRL-2和PRL-3。而其中以PRL-3在腫瘤中的生物活性最顯著。PRL-3位于染色體8q24.3上,含有PTP催化位點(diǎn)序列,其編碼蛋白產(chǎn)物含有一個保守的C-末端半胱氨酸CAAX殘基-異戊烯化結(jié)構(gòu)域,此結(jié)構(gòu)域內(nèi)的Cys104和Arg110保守催化殘基與PRL-3的酶活性有關(guān)。PRL-3蛋白在人的骨骼肌、胰腺組織及心肌細(xì)胞中有不同程度的表達(dá),而腦肺肝腎等組織鮮有表達(dá)。它具有促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖,增強(qiáng)惡性細(xì)胞遷移和浸潤能力,還有促進(jìn)細(xì)胞惡化及轉(zhuǎn)移等多種功能[4-7],具體作用機(jī)制包括以下幾點(diǎn):(1)PRL-3可通過激活Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和活動性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移;(2)PRL-3可通過介導(dǎo)ERK信號傳導(dǎo)通路,促進(jìn)腫瘤血管的生成,從而促進(jìn)腫瘤的生長及成熟,促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;(3)PRL-3可通過誘導(dǎo)促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體的過度表達(dá),促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移;(4)PRL-3還可通過調(diào)節(jié)其他癌癥相關(guān)基因的表達(dá)來介導(dǎo)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移;(5)PRL-3通過正調(diào)控PI3K細(xì)胞通路,抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分裂增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長。此外,PRL-3還可通過調(diào)節(jié)PI3K通路促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移;(6)PRL-3可促進(jìn)轉(zhuǎn)移性腫瘤的形成。

本研究顯示,SNSCC組織中的PRL-3的表達(dá)明顯高于NP組織及正常鼻腔黏膜組織,而且與SNSCC的TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此結(jié)果提示在SNSCC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中PRL-3可能發(fā)揮了重要的作用。因此,檢測PRL-3可能對早期發(fā)現(xiàn)SNSCC具有重要的臨床意義,同時(shí),對SNSCC生物學(xué)行為、預(yù)后具有重要意義,有可能成為SNSCC治療的靶點(diǎn)及預(yù)后標(biāo)記物。本研究對PRL-3高表達(dá)與SNSCC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系在分子水平上提供了一些理論基礎(chǔ),但其具體作用機(jī)制,尤其是PRL-3通過何途徑促進(jìn)SNSCC轉(zhuǎn)移的,仍需進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)

[1]孫振華,卜平.胃癌PRL-3與Bmi-1mRNA聯(lián)合表達(dá)的定量分析及其意義[J].廣東醫(yī)學(xué),2012,33(7):987-989.

[2]郭延林,朱彥君,伍青.PRL的生物學(xué)功能及與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2013,21(3):659-662.

作者:陸鴻略1,馬桂琴1,岳卓立1,康菲2 單位:承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院:1.耳鼻咽喉科;2.體檢科

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