間充質干細胞保存研究范文

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《國際檢驗醫學雜志》2014年第十二期

1資料與方法

1．1方法

1．1．1分離培養hBMSCs在志愿者髂前上棘抽取骨髓10mL。采集的骨髓用生理鹽水1∶1稀釋，密度為1．077g／L的淋巴細胞分離液2000r／min離心15min，收集白膜層，生理鹽水漂洗2次。以含10％FBS的L－DMEM作為完全培養液，以一定密度接種于75mL培養瓶中，置于37℃，5％CO2飽和濕度培養箱內培養，3d后換液去除非貼壁細胞，以后每2～3d換液1次，待細胞達80％融合時，用0．25％胰酶＋0．02％ED－TA消化，以1∶3的比例傳代培養。

1．1．2流式檢測hBMSCs表型hBMSCs用0．25％胰酶＋0．02％EDTA消化，1000r／min離心5min，生理鹽水洗滌，制備成1×106／mL單細胞懸液，分別加入熒光標記的鼠抗人CD34、CD29、CD105抗體，設置空白對照，避光冰育30min，生理鹽水洗滌3次后重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

1．1．3鑒定hBMSCs多向分化潛能以4×103／cm2密度將第3代hBMSCs接種于6孔板，每孔2mL。（1）成脂誘導及鑒定：細胞達到完全融合后4d，實驗組加入脂肪誘導液（H－DMEM，10％FCS，0．5mmol／LIBMX，10μg／mL牛胰島素，0．2mmol／Lindomethacin，1μmol／L地塞米松）誘導3d，再用脂肪保持液（H－DMEM，10μg／mL牛胰島素，10％FCS）處理1d，循環3次，再用脂肪保持液處理2d。對照組加入含10％FCS的H－DMEM，每3天換液1次。2周后油紅O染色鑒定。（2）成骨誘導及鑒定：細胞達到60％～70％融合后，實驗組加入成骨細胞誘導液（OS，含1×10－7mol／L地塞米松，10mmol／L甘油磷酸鈉，50g／mL維生素C），對照組加入L－DMEM完全培養液，置培養箱中，每2天換液1次，第21天終止誘導。茜素紅S染色鑒定。

1．1．4分組處理hBMSCs采用0．25％胰酶＋0．02％EDTA消化hBMSCs，用不同輸注液制備單細胞懸液。根據輸注液不同分為生理鹽水組（9g／L氯化鈉注射液）、糖鹽組（50g／L葡萄糖氯化鈉注射液）、清蛋白組（含5％人血清蛋白的氯化鈉注射液）。分別在4℃和25℃溫度條件下置于不同時間點（0．5、1．0、2．0、4．0，6．0h）后進行以下檢測。（1）取90μL細胞懸液與10μL胎盤藍混勻，3min內計數活細胞（未染色）和死細胞（染色），測定細胞存活率。（2）另取1×106／mL細胞行流式細胞術檢測細胞表型CD34、CD29、CD105。（3）再將不同分組細胞懸液，1000r／min離心5min，采用含10％FBS的L－DMEM作為完全培養液，以1×103／mL密度接種于96孔板，每組設3個復孔，置于37℃，5％CO2飽和濕度培養箱培養7d。采用CCK－8在酶聯免疫檢測儀上測定450nm各孔波長吸光度（A）值，以時間為橫軸，A值為縱軸繪制生長曲線。

1．2統計學處理采用SPSS17．0進行數據分析，結果用x±s表示。采用t檢驗進行兩組均數間比較，采用單因素方差分析進行多組均數間比較，采用LSD最小顯著差數法進行均數間兩兩比較。P＜0．05表示差別有統計學意義。

2結果

2．1hBMSCs形態觀察原代hBMSCs貼壁后，呈圓形，散在分布。3d后完全換液，去除未貼壁細胞，可見少量分散短梭形貼壁細胞。第14天時，貼壁細胞融合成單層，細胞排列有明顯方向性，呈漩渦狀。見圖。

2．2hBMSCs的表型流式檢測第3代hBMSCs的表型發現，CD105陽性率98．7％，CD29陽性率97．7％，表達率極高；CD34陽性率為2．9％，表達呈陰性。

2．3hBMSCs分化能力鑒定hBMSCs成脂誘導2周后，光學顯微鏡下可見大量融合成串珠狀的圓形脂滴。油紅O染色可見被染成橙紅色的脂滴，顯示分離的hBMSCs可被誘導向脂肪細胞分化。成骨誘導3周，細胞逐漸融合，失去細胞結構，14d左右出現明顯鈣結節，茜素紅S染色后可見散在大量橘紅色鈣結節，顯示培養的hBMSCs可被誘導向成骨細胞分化。

2．4hBMSCs存活率檢測在5個時間點（0．5、1．0、2．0、4．0、6．0h）對保存在25℃、4℃的3個實驗組的細胞存活率檢測，結果見表1～2。結果顯示，糖鹽組細胞存活率最低，25℃保存4．0h時只有約10％細胞存活；而清蛋白組細胞存活率最高，25℃保存2．0h時清蛋白組細胞存活率仍可達90％，差異有統計學意義（P＜0．05）。25℃和4℃條件下，保存0．5h時，生理鹽水組及清蛋白組細胞存活率都超過90％，隨著保存時間延長，各組細胞存活率逐漸下降。

2．5不同分組細胞表型檢測25℃和4℃條件下，在5個時間點（0．5、1．0、2．0、4．0、6．0h）對3個實驗組的細胞表型檢測，結果見表3～5。結果表明，不同輸注液、保存溫度及保存時間對細胞表型影響差異無統計學意義（P＞0．05）。

2．6細胞生長曲線測定將不同分組處理后的細胞，采用L－DMEM完全培養液重新接種培養，檢測細胞增殖能力，結果見圖2（見《國際檢驗醫學雜志》網站“論文附件”）。50g／L葡萄糖氯化鈉注射液組保存的細胞增殖能力最差，保存4h后細胞失去貼壁和生長能力（無細胞貼壁無法完成生長曲線）。5％人血清清蛋白氯化鈉注射液組細胞增殖能力比9g／L氯化鈉注射液組細胞增殖能力強。同一組細胞4℃條件下不同時間點的增殖能力比25℃條件下強。隨著保存時間延長，各組細胞增殖能力逐漸下降。

3討論

hBMSCs是來源于骨髓的間質干細胞，不僅能分化成肝細胞、膽管上皮細胞［4］、血管內皮細胞［5］、不同類型的皮膚細胞［6］、神經樣［7］細胞，還具有免疫調節、炎癥趨化等特性，使其在肝臟疾病、血管外科、燒傷整形外科及神經損傷等疾病治療中發揮越來越重要的作用。干細胞注射液從實驗室制備到運送至病房回輸給患者具有一定時空距離，特別是隨著異地移植病例的增多，如何有效地保存干細胞注射液，對于細胞移植的臨床應用非常重要。目前相關研究更多集中于將干細胞冷凍于－80℃或液氮等進行長期保存的探討［8－9］，有關短時保存條件對干細胞生存和生長影響的研究不多。本實驗探討了幾種臨床常用注射液在不同溫度下短時保存干細胞對細胞存活和增殖能力等狀況的影響。形態學觀察顯示，培養的細胞呈均一長梭形，輻射狀生長；流式細胞術檢測細胞表型顯示CD34表達陰性，CD29、CD105表達陽性；成脂誘導后出現大量脂滴，成骨誘導后出現鈣結節，表明該細胞確為hBMSCs。

通過3種注射液比較結果顯示，在同等溫度和時間條件下，50g／L葡萄糖氯化鈉注射液對細胞活力影響最大，可能與細胞利用葡萄糖產生大量乳酸加重細胞損傷有關；能為細胞提供營養物質的5％人血清清蛋白氯化鈉注射液對細胞活力影響最小。考慮到輸注液對細胞活力的影響，建議使用含5％人血清清蛋白氯化鈉注射液作為輸注液，如患者不宜使用，可選擇使用9g／L氯化鈉注射液，但不宜使用50g／L葡萄糖氯化鈉注射液作為輸注液。2種溫度比較結果顯示，4℃保存對細胞增殖能力的影響更小，可能相對低溫可以降低細胞代謝速度，延緩其凋亡。用于臨床治療的hBMSCs注射液室溫保存最好不要超過1．0h，不能及時回輸時需存放在4℃，但也不要超過2．0h。將干細胞保存在上述幾種注射液中，隨著保存時間延長，其存活率、貼壁及增殖能力均顯著下降，可能與注射液營養成分及生長因子等細胞生長所需要的條件缺乏有關。不同輸注液、保存溫度及保存時間對細胞表型影響差異無統計學意義（P＞0．05），表明不同保存條件不會引起細胞表面物質的脫落，僅引起細胞凋亡。綜上所述，臨床常用注射液對細胞活力影響較大，hBM－SCs一旦制備成細胞注射液，應盡可能保存在4℃，及時運送至臨床回輸給患者，這樣才能保持細胞活力，滿足臨床需要。

作者：陳京季明芳李曉玲方慧云余元龍程偉民單位：中山大學附屬中山醫院腫瘤研究所