腫瘤癌細胞論文范文

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1材料和方法

1.1半定量RT-PCR檢測VEGF的表達提取RNA方法如下：將50mL細胞培養瓶中細胞達到80%融合時，倒掉培養液，加入1mLTrizol。將培養瓶內Trizol吸取至1mLEP管中，室溫靜置5min。加入200μL氯仿，劇烈搖晃數次，室溫靜置5min，11000轉/分，4℃離心15min。取上清液加入新1mLEP管中，加入500μL異丙醇后搖晃數次。室溫靜置10min，11000轉/分，4℃離心10min。棄上清液加1mL75%乙醇后混勻。7500轉/分，4℃離心5min。棄上清液風干，加入20μL無RNA酶水，58℃加溫10min，-70℃凍存。將mRNA逆轉錄成cDNA，50μL反應體系PCR反應。VEGF（682bp）引物序列：5''''ggctctagatcgggcctccgaaaccat3''''和5''''ggctctagagcgcagagtctcctcttc3'''';β-actin（434bp）引物序列：5''''tgtgcccatctacgaggggtatgc3''''和5''''ggtacatggtggtgccgccagaca3''''。反應條件：95°C變性，30s；VEGF63.5°C退火，27循環，45s；或β-actin57°C退火，25循環，30s；72°C延伸30s。收集PCR產物1.5%瓊脂糖電泳。凝膠成像系統半定量分析。以上結果均重復3次。

1.2統計學處理采用SPSS11.5統計軟件進行統計處理，計量指標用（x軃±s）表示，ANOVA方差分析，student-Newman-Keuls檢驗，方差齊性檢驗進行顯著性檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1細胞毒性活力檢測ACC-M和ACC-2細胞在不同濃度的SNAP作用4h后細胞的活力，在0μmol/L~500μmol/L濃度的SNAP作用下，細胞的活力均保持在88%以上（表1）。經濃度100ng/mL的LPS預刺激12h后，用500μmol/L的SNAP分別作用不同時間ACC-M和ACC-2細胞活力，其活力均保持在86%以上。

2.2不同濃度SNAP對ACCs細胞中VEGF的mRNA表達水平的影響半定量RT－PCR的結果表明（圖1、圖2），在31.25μmol/LSNAP刺激下ACC-M和ACC-2細胞中VEGF的mRNA平均水平顯著升高，為2.32±0.10和2.14±0.15，分別是對照組細胞（0μmol/L）mRNA水平的4.14倍和6.90倍，差異有統計學意（P<0.01）。隨著SNAP刺激濃度升高，mR－NA水平逐漸回落：62.5μmol/LSNAP仍可明顯上調VEGF的mRNA水平（P<0.01），但不及31.25μmol/L的SNAP顯著；125μmol/L和250μmol/LSNAP對VEGFmRNA影響差異無統計學意義；而500μmol/LSNAP則顯著下調ACCs細胞中VEGF的mRNA水平（P<0.01），僅為基礎mRNA水平的0.23倍和0.17倍（表3）。One－WayANOVA檢驗和Student–Newman-Keuls檢驗比較31.25μmol/L、62.5μmol/L及500μmol/L濃度組與0對照組mRNA表達差異有統計學意義。

2.3SNAP時間依賴性抑制100ng/mLLPS誘導的VEGF的表達水平隨著500μmol/LSNAP作用時間的延長，ACCs細胞中LPS誘導的VEGFmRNA水平顯著下降（P<0.01）；當500μmol/LSNAP作用4h后，僅可檢測到極微弱的VEGFmRNA條帶，其mRNA的平均表達水平顯著低于LPS誘導12h后SNAP作用0小時組的mRNA水平（表4）。半定量RT－PCR的結果（見圖3、圖4）。One－WayANOVA檢驗和Student-Newman-Keuls檢驗比較其他各時間組與0對照組mRNA表達差異有統計學意義（P<0.05）。

3討論

一氧化氮（NO）是一種極不穩定的生物自由基，其生成依賴于細胞內的一氧化氮合成酶（nitricoxidesynthaseenzyme，NOS）。它能通過傳遞電子的反應參與機體的氧化還原反應，在生物體內發揮重要生理作用。目前越來越多的研究證實，NO在腫瘤細胞中發揮著雙向調節的作用。研究發現，腫瘤微血管內皮細胞和腫瘤基質細胞中NOS的高表達，能抑制腫瘤的生長和局部浸潤。而另一些研究表明，NO具有促進腫瘤血管發生和局部侵襲性。不同的NO濃度是其在腫瘤調控中發揮著截然相反作用的主要原因。高濃度的NO在生物體內形成過氧亞硝基（OONO-）和N3O2，能氧化或硝化DNA導致DNA單鏈斷裂、抑制DNA的合成以及核苷酸還原酶的活性，并能抑制體內的磷酸化信號通路的活化促進腫瘤細胞的凋亡。而低濃度的NO被證實與腫瘤微血管發生、腫瘤浸潤和轉移相關。因此將NO作為腫瘤治療的重要手段的同時，應充分認識低濃度的NO對腫瘤促進作用。本實驗證明NO的供體SNAP對ACCs細胞有著雙向調控作用，當SNAP的刺激濃度在31.25μmol/L時能顯著上調血管發生相關因子的表達，而當SNAP的刺激濃度在500μmol/L時血管發生相關因子的表達被有效抑制。

大量研究證明，NO誘導的血管發生相關因子的異常表達，在促進腫瘤微血管發生方面發揮著重要的作用。Jenkins等[8]首次報道在人腫瘤細胞中，轉入iNOScDNA閱讀框后腫瘤生長加速，且伴隨著大量微血管的發生。Ambs等的實驗證實，在異種種植瘤內NO能誘導VEGF表達增高，促進腫瘤微血管發生。可見在ACC中，相對低濃度的NO可能通過上調VEGF表達來促進腫瘤微血管發生。

隨著對NO的抗腫瘤特性研究的逐漸深入，NO被視為一種頗具前景的腫瘤細胞殺傷因子，然而NO對腫瘤調控的雙向效應增加了其作為抗腫瘤藥物的復雜性。因此研究不同濃度NO對ACCs細胞的調控作用和調控途徑，將更加有利于研究其對ACCs的抑制作用。本實驗結果發現，當SNAP濃度為31.25μmol/L時，ACCs細胞中VEGF表達顯著增高。當SNAP濃度為500μmol/L時，LPS誘導的VEGF的高表達被明顯抑制，且具有時間依賴性。提示500μmol/LSNAP能有效抑制ACCs血管發生相關因子的表達，提示高濃度NO可能在抑制ACCs血管發生過程中發揮著重要的作用。

作者：陳錦袁蘇健單位：長江航運總醫院武漢腦科醫院口腔科