葉酸抑制胃癌細(xì)胞論文范文

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1實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)分組按事先轉(zhuǎn)染的成分不同以及后續(xù)培養(yǎng)基不同分為先行PLK－1siRNA干擾然后在無葉酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h組(Null+PLKS組)、先行PLK－1siRNA干擾然后在正常葉酸濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h組(Control+PLKS組)、無PLK－1siRNA而用PBS作對照的轉(zhuǎn)染然后在無葉酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h組(Null+PBS組)、無PLK－1siRNA而用PBS作對照的轉(zhuǎn)染然后在正常葉酸濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h組(Control+PBS組)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PLK－1siRNALipofectamineTM2000的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照說明書施行。其基本步驟為:轉(zhuǎn)染前24h，在每塊6孔板的每個孔內(nèi)用2mL不含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基接種對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞5×105個。經(jīng)過24h，細(xì)胞融合度為40%。用250μLOpti－MEM培養(yǎng)基稀釋siRNA(siRNA的量為100pmol)，混勻。用250μLOpti－MEM稀釋5．0μLLipofectamineTM2000，混勻，室溫下靜置5min。將以上混合轉(zhuǎn)染試劑和siRNA稀釋液混勻，室溫下靜置20min。轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔細(xì)胞板中，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻。轉(zhuǎn)染6h后換新鮮培養(yǎng)基。

1.2.2Real－timePCR和Westernblot驗(yàn)證PLK－1siRNA干擾的效果細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，然后用RIPA和Trizol分別提取蛋白和RNA。蛋白以GAPDH為內(nèi)參，用Westernblot檢驗(yàn)其表達(dá)差別。siRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后行Real－time檢測PLK－1siRNA的轉(zhuǎn)錄水平差別。PLK－1和GAPDH的引物由上海生工合成，引物序列見表1。

1.2.3CCK－8檢測細(xì)胞增殖情況經(jīng)不同PLK－1siRNA干擾或者PBS作為對照的干擾組，6h后，胰酶消化收集細(xì)胞，將其按96孔板每個孔2000個細(xì)胞的密度接種，每次取5復(fù)孔，按4組要求分別加入正常葉酸濃度的培養(yǎng)基和不含葉酸的培養(yǎng)基后，分別培養(yǎng)72h，然后棄去培養(yǎng)基，分別加入上述對應(yīng)的培養(yǎng)基100mL和CCK－810μL的混合液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3h，檢測吸光度，觀察細(xì)胞增殖情況。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和增殖情況在6孔板轉(zhuǎn)染后，經(jīng)不同PLK－1siRNA干擾或者PBS作為對照的干擾組，干擾6h后吸去干擾液，按4組要求分別加入正常葉酸濃度的培養(yǎng)基和不含葉酸的培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h。收取上清液中的懸浮細(xì)胞+胰酶消化后的細(xì)胞，離心，PBS洗2次。然后按AnnexinV試劑盒操作流程染色。實(shí)驗(yàn)總共設(shè)一個陰性對照管、AnnexinV和PI單染管和實(shí)驗(yàn)管，每管細(xì)胞約1×106。室溫避光孵育15min，流式上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。對于周期，收集的各組細(xì)胞加入70%(PBS稀釋)－20℃無水乙醇2～3mL，4℃固定6h以上。1500r/min去上清，1mLPBS1500r/min5min清洗1遍，加入200μLPBS重新懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度為106～107，加入1%的Rnase60μL，37℃搖床水浴30min。加入20μL250μg/mL的PI，室溫避光孵育10min上機(jī)檢測。

1.2.5Westernblot檢測Bcl－2表達(dá)情況RIPA提取蛋白后，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物研究所)測定蛋白濃度，調(diào)整濃度后用SDS上樣緩沖液加熱變性后，蛋白電泳檢測蛋白表達(dá)差異。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS19．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。所有結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x珋±s)表示。各組間差異比較使用析因方差分析，多組間均數(shù)比較采用F檢驗(yàn)，均數(shù)間的兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組PLK－1mRNA水平和蛋白表達(dá)情況轉(zhuǎn)染72h后檢測PLK－1mRNA和蛋白的表達(dá)情況。Real-timePCR檢測發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞系SGC7901和BGC823，PLK－1mRNA在用PLK－1siRNA干擾的PLKS組較PBS干擾的PBS組明顯降低，見圖1。同樣，在蛋白表達(dá)水平上，Westernblot顯示經(jīng)PLK－1siRNA干擾，胃癌細(xì)胞系SGC7901和BGC823的PLK－1蛋白水平也明顯降低，見圖2及圖3。

2.2各組SGC7901和BGC823細(xì)胞增殖情況比較在接種相同數(shù)目細(xì)胞的前提下，細(xì)胞數(shù)目少反映PLKS組細(xì)胞增殖較慢。析因方差分析顯示葉酸缺乏和PLK－1siRNA對SGC7901和BGC823細(xì)胞增殖均有明顯影響，且葉酸缺乏和PLK－1siRNA對胃癌細(xì)胞系SGC7901和BGC823有交互作用(P值分別為0．046和0．006)。因Null－PLKS組均數(shù)＜Null－PBS組均數(shù)+Control－PLKS均數(shù)－Control－PBS組均數(shù)(SGC7901和BGC823細(xì)胞系計(jì)算值分別為0．227＜0．316和0．309＜0．485)，所以葉酸缺乏和PLK－1對胃癌細(xì)胞系SGC7901和BGC823的增殖抑制具有協(xié)同作用。

2.3各組SGC7901和BGC823細(xì)胞凋亡情況比較AnnexinV檢測細(xì)胞凋亡情況，流式圖橫坐標(biāo)為標(biāo)FITC的AnnexinV，縱坐標(biāo)為PI。SGC7901的早期凋亡(Q4象限)在Null－PLKS組、Null－PBS組、Control－PLKS組和Control－PBS組分別為(26．42±1．50)%，(5．13±1．24)%，(10．17±1．76)%和(6.17±2．47)%。BGC823的早期凋亡(Q4象限)在Null－PLKS組、Null－PBS組、Control－PLKS組和Control－PBS組分別為(24．28±2．90)%，(6．88±2．05)%，(13．30±2.58)%和(5.80±3．01)%。析因方差分析得出，PLK－1siRNA能促進(jìn)凋亡，但葉酸缺乏對凋亡影響不大;葉酸缺乏與PLK－1siRNA之間有交互效應(yīng)。因Null－PLKS組均數(shù)＜Null－PBS組均數(shù)+Control－PLKS均數(shù)－Control－PBS組均數(shù)(SGC7901和BGC823細(xì)胞系計(jì)算值分別為:26．42＞9.13和24．28＞14．38)，所以葉酸缺乏能增強(qiáng)PLK－1對胃癌細(xì)胞系SGC7901和BGC823的促凋亡作用。

2.4各組SGC7901和BGC823細(xì)胞周期情況SGC7901G2/M比例在Null－PLKS組、Null－PBS組、Control－PLKS組和Control－PBS組分別為(20．88±2．55)%，(8．32±2．18)%，(19．49±1．98)%和(7．48±1．68)%;BGC823G2/M比例在各組分別為(22．95±2．71)%，(11．61±2．66)%，(22．01±2．94)%和(10．03±2．47)%。對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)PLK－1siRNA能提高G2/M比例(P＜0．05)，但葉酸缺乏不能，而且葉酸缺乏和PLK－1siRNA之間也無交互作用(P＞0．05)。見圖6及圖7。

2.5各組SGC7901和BGC823細(xì)胞Bcl－2蛋白表達(dá)情況葉酸缺乏和PLK－1siRNA均能降低Bcl－2的表達(dá)，而且葉酸缺乏和PLK－1siRNA對BCL－2的表達(dá)有交互效應(yīng)(P＜0．05)。鑒于兩者Null－PLKS組均數(shù)＞Null－PBS組均數(shù)+Control－PLKS均數(shù)－Control－PBS組均數(shù)，葉酸缺乏和PLK－1siRNA具有拮抗作用。

3討論

腫瘤是一個全身性疾病，手術(shù)對腫瘤尤其是中晚期腫瘤其是胃癌治療效果有限。基于腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的綜合治療，尤其是聯(lián)合治療有其特有的優(yōu)勢。PLK－1作為PLK家族中被研究最多的一員，不僅在很多腫瘤中表達(dá)升高，而且它的升高還對諸如胃癌、結(jié)直腸癌的預(yù)后判斷具有價值。PLK－1參與了數(shù)個至關(guān)重要的有絲分裂步驟，如激活CDC25c磷酸化酶、調(diào)節(jié)有絲分裂過程等。PLK－1具有參與多個腫瘤發(fā)生、發(fā)展步驟的特點(diǎn)。所以，PLK－1被認(rèn)為是重要的分子靶標(biāo)，并被廣泛關(guān)注。Bcl－2是一個經(jīng)典的抗凋亡蛋白，降低Bcl－2能促進(jìn)腫瘤凋亡，抑制腫瘤生長。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用PLK－1的siR-NA敲低PLK－1后，胃癌細(xì)胞系SGC7901和BGC823的增殖降低，凋亡增加，細(xì)胞阻滯在G2/M期，且葉酸缺乏聯(lián)合PLK－1siRNA能抑制Bcl－2的表達(dá)，提示降低PLK－1可能通過Bcl－2途徑起作用，這與其他研究的結(jié)果類似。葉酸是生物體代謝重要的一碳單位，葉酸類似物如甲氨蝶呤被用作腫瘤的治療。本研究證實(shí)PLK－1siRNA能抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，葉酸缺乏也能抑制腫瘤的增殖，且葉酸能協(xié)同PLK－1siRNA抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但在抑制胃癌細(xì)胞Bcl－2的表達(dá)上有拮抗作用。

筆者認(rèn)為，這可能與蛋白的作用往往不是與濃度呈線性關(guān)系有關(guān)，該結(jié)果有待進(jìn)一步研究。葉酸缺乏和PLK－1siRNA協(xié)同抑制腫瘤的意義在于，使用PLK－1抑制劑時補(bǔ)充葉酸，尤其是大量補(bǔ)充應(yīng)慎重。不僅如此，PLK－1抑制劑聯(lián)合臨床使用的抗葉酸制劑，如甲氨蝶呤、普拉曲沙(pralatrexate)等，能否達(dá)到更好治療腫瘤的目的也值得深入研究。

作者：查小應(yīng)黃磊楊木清歐敬民陳大偉費(fèi)哲為單位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院