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《生物工程學報雜志》2014年第六期
1材料與方法
1.1標本來源
20例孕中期(孕16−22周)羊水標本來自在上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院進行血友病產前診斷檢查剩余的廢棄羊水標本。所有羊水標本的使用經孕婦知情同意，并經瑞金醫院倫理委員會通過。
1.2主要試劑
羊水細胞完全培養基II和TRIZOL是美國Invitrogen公司的產品；75cm2培養瓶購自美國Corning公司；RT-PCR試劑盒購于羅氏公司；PCR引物自行設計由Invitrogen公司合成，序列見表1。免疫熒光抗體見表2。phFIX質粒由上海醫學遺傳研究所曾溢滔教授惠贈。
1.3方法
1.3.1羊水細胞分離和培養將無血液污染的孕中期羊水標本(10mL)400×g離心10min,棄上清，加入完全培養基AmniomaxIIcomplete2mL，將細胞懸浮后接種至6孔板中，培養皿經0.2%明膠包被，隨后置于95％濕度，5％CO2，通過培養基本身對貼壁細胞的自然選擇來對羊水細胞進行分離選擇培養。37℃的培養箱中培養6d后，首次換微鏡下觀察，畫出呈致密克隆生長的梭形細胞集落的范圍，用無菌細胞刮鏟輕刮標定范圍，刮下細胞用培養液制成細胞懸液，調整細胞濃度為4×104/mL，接種至24孔培養板中，記為第1代(P1)。以后每隔2—3d用換液1次，當細胞長到60%−70％融合時進行1:3的消化傳代。
1.3.2細胞生長曲線繪制取80％融合的P3、P5和P10hAFPCs，消化成單細胞懸液，調整細胞濃度為2×104/mL接種于24孔培養板，每孔0.5mL，置培養箱培養，每3d更換培養液。從第2天起每隔24h隨機取3孔細胞計數取其平均值作為當天的細胞數，繪制9d的細胞生長曲線，接種24h后計算細胞倍增時間，公式為TD=t×log2/log(Nt/No)(Nt為t時間的細胞數，No為初種細胞數)。
1.3.3熒光免疫染色細胞經4％多聚甲醛進行固定30min后用加入封閉液阻斷細胞30min，隨后在4℃下加入一抗孵育過夜，稀釋比如下，TRA-1-60(1:100)，SSEA4(1:100)，用無抗體的PBS孵育作為陰性對照．次日用PBS將未結合的抗體洗脫，加入二抗后在37℃孵育lh(二抗稀釋比例:l:100)，用DAPI進行核染10min；防淬滅液封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。
1.3.4RNA抽提根據Invitrogen公司的TRIZOL操作說明書進行。1mLTRIZOL加入106細胞中，抽提完成后，50μL的水溶解RNA樣品，測O.D值定量RNA濃度。
1.3.5逆轉錄按ROCHERTkit操作步驟，取2μg的RNA作為逆轉錄摸板在40μL反應體系中逆轉錄cDNA(ComplementaryDNA)。1.3.6載體構建利用GatewayTechnolgy系統構建質粒(圖7A)。
1.3.7慢病毒包裝與轉染采用第3代慢病毒系統，pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G，根據Lipofectamine2000的操作步驟轉染293T細胞，48h收獲含病毒的上清，以0.45μm濾器過濾即加入已貼壁的AFPCs，同時加入polybrene至6μg/mL，繼續培養24h，用新鮮培養基替換含有病毒的培養基。
1.3.8流式細胞儀篩選GFP陽性細胞培養細胞達90%密度后，用0.25%的胰酶消化。PBS洗滌細胞2次，再用PBS懸浮細胞，調整細胞濃度5×106−8×106/mL。以未轉染的hAFPC為陰性對照。
1.3.9ELISA檢測培養液中hFIX濃度檢測樣品時均設二復孔測定，以保證檢測結果的準確性。以10個健康個體的混合血漿作為標準物稀釋后設定橫坐標(對數坐標)，OD值為縱坐標(對數坐標)，得到雙對數標準曲線，將樣品的OD值代入方程式，所得hFIX濃度以正常人的血漿濃度的百分比來表示。1.3.10凝集測定實驗(Clottingassay)測定培養上清hFIX活性通過使用人因子IX缺乏的血漿來做凝血分析，采用BECKMAN公司的ACLTOP全自動凝血分析儀測定FIX活性。10個健康人的混合血漿的血液凝固參數作為對照標準，其活性為100％。
1.4統計學方法
采用SPSS13.0軟件分析，實驗數據用均數±標準差(x±s)表示，各組均值比較采用t檢驗，P<0.05為有顯著性差異。
2結果與分析
2.1羊水祖細胞(hAFPCs)的分離和培養孕中期羊水細胞接種于培養皿后，原代羊水細胞包括兩種細胞群：貼壁細胞和非貼壁細胞，而hAFPCs屬于貼壁細胞群。培養3d后，在倒置相差顯微鏡下觀察，可見呈克隆樣生長的梭形貼壁羊水細胞，細胞間排列緊密，核大，核仁分裂象可見。6d后，呈克隆樣生長的梭形細胞為主的hAFPCs集落形成(圖1)(在20例標本皆培養成功)。原代羊水祖細胞排列有一定的方向性，呈旋渦狀、網狀及輻射狀排列生長(圖2A)。集落生長的羊水祖細胞原代生長到第8天時，輕輕的擁無菌刮板刮下后傳代至24孔板，記為P1，傳代細胞在12h內完全貼壁，約7d后細胞融合80%，再次傳代(P2)。傳代后生長迅速，按照l:3的比例進行傳代時，需3−4d傳代一次。刮下的hAFPCs接種培養后，細胞呈均勻分布生長，形態呈梭形。大約7d達到80％融合(圖2B)，傳到第3代時hAFPCs克隆呈現出均一的成纖維樣細胞(圖2C)。傳至第12代，細胞仍呈現均一的成纖維樣，生長速度略有下降(圖2D)。羊水祖細胞生長曲線(圖3)具有以下共同特征：接種后第1−2天為潛伏適應期，從第3天起進入指數生長期，第7天達到高峰，以后進入平臺期。P3代hAFPCs的群體倍增時間為39.05h，P5代為41.04h，P10代為43.18h，羊水來源的祖細胞隨著傳代次數的增加增殖能力略有下降。
2.2羊水祖細胞中NANOG,OCT4,SOX2mRNA的表達用定量RT-PCR的方法檢測了機械分離出的3株AFPC(1−3)表達干細胞特征基因的情況，選取管家基因ß-actin為內參照，293T細胞為陰性對照，ESCs為陽性對照。發現NANOG，OCT4，SOX2mRNA在羊水祖細胞(AFPC)中都有表達(圖4)，與胚胎干細胞相比，分離出的AFPC表達較高水平的NANOG，SOX2mRNA，均高于ES細胞，其中NANOG的表達較高，達2.9倍(P<0.05)。OCT4mRNA的表達比ES細胞低，僅有0.15倍的痕跡量(P<0.05)。
2.3免疫熒光法檢測胚胎干細胞特異性蛋白在羊水祖細胞中的表達為進一步鑒定分離出的hAFPC的特性，我們用免疫化學熒光法來檢測一系列在胚胎干細胞表面特異性表達的蛋白SSEA4，TRA1-60，結果發現大部分細胞可見SSEA4，TRA1-60在細胞表面呈陽性(圖5)。
2.4羊水祖細胞體外成脂肪和成骨誘導分化倒置相差顯微鏡觀察可見，經成脂肪細胞誘導后細胞增殖速度下降，細胞形態發生明顯變化，由長梭形變為多邊形，誘導7d后細胞內出現圓形脂滴，以后脂滴逐漸增多增大，誘導21d，大多數細胞內充滿了脂滴，經油紅O染色證實為脂滴(圖6A-B)。經成骨誘導5−7d，細胞呈片狀重疊生長，細胞形態變得扁平，經堿性磷酸酶染色(AP染色)提示細胞內有大量酶顆粒形成，與成骨細胞活性相關的堿性磷酸酶表達陽性(圖6C−D)。
2.5轉染質粒后的AFPC人羊水祖細胞轉染PLV-hFIX-GFP質粒72小時后，可見較弱的綠色熒光，96d后熒光明顯增強，細胞形態沒有變化仍維持成纖維樣(圖7E)，用胰酶消化后進行流式細胞儀檢測，發現陽性細胞為54.91%(圖7B)，轉染效率可達50%以上。通過流逝篩選出GFP陽性的細胞，經含雙倍抗生素的培養液懸浮后移入6孔板中繼續培養。篩選出的細胞經2代擴增后，再次進行流式細胞儀檢測有綠色熒光的細胞比例，綠色熒光陽性的細胞占95%以上(圖7D)，并且在24h內貼壁，48h后進入快速增長期。
2.6轉染后AFPC表達hFIX抗原濃度(hFIX:Ag)和hFIX活性(hFIX:C)為了檢測轉染后的羊水祖細胞能否合成FIX并向外分泌，我們以每孔1×105的AFPC重新種植在24孔板繼續培養8d，分別在每2d換液時留取細胞培養上清液約100uL，-20℃冰箱保存，直到進行檢測FIX:C和FIX:Ag。轉染后2d，AFPC已合成hFIX蛋白，在上清液中的濃度為20.77%±2.77%(圖8)，凝血活性16.42%±1.78%。FIX的合成在傳代后的第4天達到平臺期，為50.35%±5.42%，%此后第6天和第8天FIX濃度分別為51.10%±6.53%，54.23%±4.98%。轉染后的羊水細胞表達的hFIX蛋白的水平呈現基本穩定趨勢，波動幅度較小。我們還發現上清液中的FIX在凝血實驗中也表現出凝血活性，并隨著濃度的升高而相應增高，最高可達47.54%±3.24%(相對于正常人血清中FIX的活性)。
3討論
羊水中有來自胎兒皮膚、消化道、呼吸道和泌尿道等組織的脫落細胞，也有來自羊膜及早期胚胎組織的脫落細胞。其中具有干細胞性質的細胞比例尚無統一的研究結論。Prusa等[11]報道羊水中表達OCT4的細胞約為0.1%−0.5%，DeCoppi等分選的CD117陽性細胞占原代細胞的1％。這些數據提示羊水中干細胞數目有限，如何對其進行有效的分離和擴增培養尤為重要。羊水細胞來源及成分復雜，不同來源的細胞貼壁、生長能力不同，因此培養條件在羊水干細胞的分離培養中起重要作用。本研究使用富含包括bFGF等各類生長因子的AmniomaxcompleteII，有利于羊水祖細胞貼壁生長，并通過機械刮下呈克隆生長的梭形細胞，成功地分離得到形態均一的羊水祖細胞，并對其生物學特點進行了研究。本實驗分離得到的羊水祖細胞來源于常規孕中期產前診斷時剩余的羊水標本，與ESCs相比，不會破壞胚胎組織，因此避免了ESCs的倫理問題；與BM-hMSCs相比，AFPC標本獲取是在超聲引導下行羊膜腔穿刺得到的，創傷較小，而且AFPC在較長時間內維持自我更新和復制的能力，P10代的生長速度較P3代僅略有下降，與Sayago等報道的相一致。同時我們得到的AFPC還能保持穩定的生物學特性：第3代和第10代AFPC形態上沒有明顯的區別。有人報道，與骨髓和臍血的hMSCs(第4代)中的端粒酶長度相比，第6代人羊水間充質干細胞的端粒酶長度明顯長。
這一發現也表明了羊水來源的干/祖細胞比成體的hMSCs有較高的增殖能力，可能是由于AFDC是來源于胚胎早期，更接近ESCs。研究表明人類ES細胞中至少有353個靶基因是OCT4、SOX2和NANOG三者共同擁有的，且3個轉錄因子在這些基因啟動子上的結合位點都相互接近。我們在實驗中發現AFPC能夠在mRNA分子水平同時表達這3個與胚胎干細胞相關的分子。與胚胎干細胞相比，OCT-4的表達量較低，但有趣的是我們分離得到的羊水祖細胞表達的NANOGmRNA和SOX2mRNA的水平比ESCs還高。大量研究表明，OCT4、NANOG這兩個同源異型域基因是體內外維持干細胞自我更新和保持未分化狀態的關鍵轉錄因子。OCT4的表達水平需維持在一定的水平，如果OCT4過表達，將使胚胎干細胞向內胚層細胞分化，而NANOG的高表達可使人類胚胎干細胞不需要滋養層細胞就可維持干性。最近的一項研究發現表達SOX2的胎兒組織將發育為含有表達SOX2的成體干細胞的組織，在胃、食管道、睪丸、子宮頸、肛門和眼睛晶狀體等組織特異性成體細胞群體中表達，并能夠更新它們的群體，必要時在特定組織中產生完全分化的細胞。這些現象表明SOX2似乎是一種在所有發育階段：胚胎、胎兒和成體干細胞中表達的重要轉錄因子。本實驗中分離得到的AFPC在mRNA水平同時表達OCT4，NANOG，SOX2這三個關鍵基因，其中NANOG和SOX2的表達水平較高，因此羊水祖細胞可能是介于胚胎干細胞和成體干細胞之間的一種細胞。為了觀察羊水祖細胞能否應用于血友病B的基因治療，我們通過慢病毒載體同時轉入目的基因FIX-cDNA和報告基因GFP。本文使用的hFIXcDNA來自肝臟表達文庫，同時克隆hFIX基因內含子的部分序列，置于hFIX之前，具有高效表達的優點。hFIX作為人體血漿中重要的凝血因子，正常情況下由肝細胞合成。
最初在肝臟中生成的hFIX是一種酶原，經過在第157位和167位門冬氨酸部位的糖基化。N端12個谷氨酸的羧基化，以及在肽鏈中Arg45-Ala和Ar180-vaJ處精氨酰氨鍵的斷裂，剪除146−180位共35個氨基酸的肽鏈，生成一條由145個氨基酸構成的輕鏈和另一條由236個氨基酸構成的重鏈，并通過二硫鍵連接起來，最終形成具有絲氨酸蛋白酶活性的活化hFlX。慢病毒載體可以把人凝血因子IX(hFIX)穩定轉染到羊水祖細胞，并且體外實驗發現FIX能夠在羊水祖細胞內合成并分泌到上清液中，而該蛋白的表達水平呈現基本穩定趨勢，波動幅度較小，上清液中的濃度在第4天能達到平臺期。檢測到的FIX凝血活性也與其蛋白濃度呈正相關因此，在體外的培養系統中，羊水祖細胞不僅能夠合成hFIX，而且能正確剪切及修飾該蛋白，使其具有正常的凝血功能。轉染了hFIX的羊水祖細胞在體外能持續合成有凝血功能的hFIX蛋白，同時保持原有的形態和增殖速度，為基因治療提供了一種新型載體，羊水祖細胞可能成為胚胎干細胞和成體干細胞以外更好的、合適的細胞來源之一。為血友病B產前治療的新方法提供了實驗基礎和理論依據。
作者：楊辰敏范書玥唐匯祥鞏芷娟龔秀麗任兆瑞曾凡一單位：上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院婦產科上海交通大學醫學院醫學科學研究院發育生物學研究室上海交通大學醫學院附屬兒童醫院上海醫學遺傳研究所衛生部醫學胚胎分子生物學重點實驗室及上海市胚胎與生殖重點實驗室