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《生物工程學(xué)報(bào)雜志》2014年第六期
1材料與方法
1.1標(biāo)本來源
20例孕中期(孕16−22周)羊水標(biāo)本來自在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院進(jìn)行血友病產(chǎn)前診斷檢查剩余的廢棄羊水標(biāo)本。所有羊水標(biāo)本的使用經(jīng)孕婦知情同意，并經(jīng)瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。
1.2主要試劑
羊水細(xì)胞完全培養(yǎng)基II和TRIZOL是美國Invitrogen公司的產(chǎn)品；75cm2培養(yǎng)瓶購自美國Corning公司；RT-PCR試劑盒購于羅氏公司；PCR引物自行設(shè)計(jì)由Invitrogen公司合成，序列見表1。免疫熒光抗體見表2。phFIX質(zhì)粒由上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所曾溢滔教授惠贈(zèng)。
1.3方法
1.3.1羊水細(xì)胞分離和培養(yǎng)將無血液污染的孕中期羊水標(biāo)本(10mL)400×g離心10min,棄上清，加入完全培養(yǎng)基AmniomaxIIcomplete2mL，將細(xì)胞懸浮后接種至6孔板中，培養(yǎng)皿經(jīng)0.2%明膠包被，隨后置于95％濕度，5％CO2，通過培養(yǎng)基本身對(duì)貼壁細(xì)胞的自然選擇來對(duì)羊水細(xì)胞進(jìn)行分離選擇培養(yǎng)。37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d后，首次換微鏡下觀察，畫出呈致密克隆生長的梭形細(xì)胞集落的范圍，用無菌細(xì)胞刮鏟輕刮標(biāo)定范圍，刮下細(xì)胞用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104/mL，接種至24孔培養(yǎng)板中，記為第1代(P1)。以后每隔2—3d用換液1次，當(dāng)細(xì)胞長到60%−70％融合時(shí)進(jìn)行1:3的消化傳代。
1.3.2細(xì)胞生長曲線繪制取80％融合的P3、P5和P10hAFPCs，消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104/mL接種于24孔培養(yǎng)板，每孔0.5mL，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3d更換培養(yǎng)液。從第2天起每隔24h隨機(jī)取3孔細(xì)胞計(jì)數(shù)取其平均值作為當(dāng)天的細(xì)胞數(shù)，繪制9d的細(xì)胞生長曲線，接種24h后計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間，公式為TD=t×log2/log(Nt/No)(Nt為t時(shí)間的細(xì)胞數(shù)，No為初種細(xì)胞數(shù))。
1.3.3熒光免疫染色細(xì)胞經(jīng)4％多聚甲醛進(jìn)行固定30min后用加入封閉液阻斷細(xì)胞30min，隨后在4℃下加入一抗孵育過夜，稀釋比如下，TRA-1-60(1:100)，SSEA4(1:100)，用無抗體的PBS孵育作為陰性對(duì)照．次日用PBS將未結(jié)合的抗體洗脫，加入二抗后在37℃孵育lh(二抗稀釋比例:l:100)，用DAPI進(jìn)行核染10min；防淬滅液封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。
1.3.4RNA抽提根據(jù)Invitrogen公司的TRIZOL操作說明書進(jìn)行。1mLTRIZOL加入106細(xì)胞中，抽提完成后，50μL的水溶解RNA樣品，測(cè)O.D值定量RNA濃度。
1.3.5逆轉(zhuǎn)錄按ROCHERTkit操作步驟，取2μg的RNA作為逆轉(zhuǎn)錄摸板在40μL反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄cDNA(ComplementaryDNA)。1.3.6載體構(gòu)建利用GatewayTechnolgy系統(tǒng)構(gòu)建質(zhì)粒(圖7A)。
1.3.7慢病毒包裝與轉(zhuǎn)染采用第3代慢病毒系統(tǒng)，pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G，根據(jù)Lipofectamine2000的操作步驟轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h收獲含病毒的上清，以0.45μm濾器過濾即加入已貼壁的AFPCs，同時(shí)加入polybrene至6μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24h，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。
1.3.8流式細(xì)胞儀篩選GFP陽性細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)90%密度后，用0.25%的胰酶消化。PBS洗滌細(xì)胞2次，再用PBS懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度5×106−8×106/mL。以未轉(zhuǎn)染的hAFPC為陰性對(duì)照。
1.3.9ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液中hFIX濃度檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)二復(fù)孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。以10個(gè)健康個(gè)體的混合血漿作為標(biāo)準(zhǔn)物稀釋后設(shè)定橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))，OD值為縱坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))，得到雙對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的OD值代入方程式，所得hFIX濃度以正常人的血漿濃度的百分比來表示。1.3.10凝集測(cè)定實(shí)驗(yàn)(Clottingassay)測(cè)定培養(yǎng)上清hFIX活性通過使用人因子IX缺乏的血漿來做凝血分析，采用BECKMAN公司的ACLTOP全自動(dòng)凝血分析儀測(cè)定FIX活性。10個(gè)健康人的混合血漿的血液凝固參數(shù)作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，其活性為100％。
1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS13.0軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，各組均值比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異。
2結(jié)果與分析
2.1羊水祖細(xì)胞(hAFPCs)的分離和培養(yǎng)孕中期羊水細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿后，原代羊水細(xì)胞包括兩種細(xì)胞群：貼壁細(xì)胞和非貼壁細(xì)胞，而hAFPCs屬于貼壁細(xì)胞群。培養(yǎng)3d后，在倒置相差顯微鏡下觀察，可見呈克隆樣生長的梭形貼壁羊水細(xì)胞，細(xì)胞間排列緊密，核大，核仁分裂象可見。6d后，呈克隆樣生長的梭形細(xì)胞為主的hAFPCs集落形成(圖1)(在20例標(biāo)本皆培養(yǎng)成功)。原代羊水祖細(xì)胞排列有一定的方向性，呈旋渦狀、網(wǎng)狀及輻射狀排列生長(圖2A)。集落生長的羊水祖細(xì)胞原代生長到第8天時(shí)，輕輕的擁無菌刮板刮下后傳代至24孔板，記為P1，傳代細(xì)胞在12h內(nèi)完全貼壁，約7d后細(xì)胞融合80%，再次傳代(P2)。傳代后生長迅速，按照l:3的比例進(jìn)行傳代時(shí)，需3−4d傳代一次。刮下的hAFPCs接種培養(yǎng)后，細(xì)胞呈均勻分布生長，形態(tài)呈梭形。大約7d達(dá)到80％融合(圖2B)，傳到第3代時(shí)hAFPCs克隆呈現(xiàn)出均一的成纖維樣細(xì)胞(圖2C)。傳至第12代，細(xì)胞仍呈現(xiàn)均一的成纖維樣，生長速度略有下降(圖2D)。羊水祖細(xì)胞生長曲線(圖3)具有以下共同特征：接種后第1−2天為潛伏適應(yīng)期，從第3天起進(jìn)入指數(shù)生長期，第7天達(dá)到高峰，以后進(jìn)入平臺(tái)期。P3代hAFPCs的群體倍增時(shí)間為39.05h，P5代為41.04h，P10代為43.18h，羊水來源的祖細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增加增殖能力略有下降。
2.2羊水祖細(xì)胞中NANOG,OCT4,SOX2mRNA的表達(dá)用定量RT-PCR的方法檢測(cè)了機(jī)械分離出的3株AFPC(1−3)表達(dá)干細(xì)胞特征基因的情況，選取管家基因ß-actin為內(nèi)參照，293T細(xì)胞為陰性對(duì)照，ESCs為陽性對(duì)照。發(fā)現(xiàn)NANOG，OCT4，SOX2mRNA在羊水祖細(xì)胞(AFPC)中都有表達(dá)(圖4)，與胚胎干細(xì)胞相比，分離出的AFPC表達(dá)較高水平的NANOG，SOX2mRNA，均高于ES細(xì)胞，其中NANOG的表達(dá)較高，達(dá)2.9倍(P<0.05)。OCT4mRNA的表達(dá)比ES細(xì)胞低，僅有0.15倍的痕跡量(P<0.05)。
2.3免疫熒光法檢測(cè)胚胎干細(xì)胞特異性蛋白在羊水祖細(xì)胞中的表達(dá)為進(jìn)一步鑒定分離出的hAFPC的特性，我們用免疫化學(xué)熒光法來檢測(cè)一系列在胚胎干細(xì)胞表面特異性表達(dá)的蛋白SSEA4，TRA1-60，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞可見SSEA4，TRA1-60在細(xì)胞表面呈陽性(圖5)。
2.4羊水祖細(xì)胞體外成脂肪和成骨誘導(dǎo)分化倒置相差顯微鏡觀察可見，經(jīng)成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)后細(xì)胞增殖速度下降，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，由長梭形變?yōu)槎噙呅危T導(dǎo)7d后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)圓形脂滴，以后脂滴逐漸增多增大，誘導(dǎo)21d，大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)充滿了脂滴，經(jīng)油紅O染色證實(shí)為脂滴(圖6A-B)。經(jīng)成骨誘導(dǎo)5−7d，細(xì)胞呈片狀重疊生長，細(xì)胞形態(tài)變得扁平，經(jīng)堿性磷酸酶染色(AP染色)提示細(xì)胞內(nèi)有大量酶顆粒形成，與成骨細(xì)胞活性相關(guān)的堿性磷酸酶表達(dá)陽性(圖6C−D)。
2.5轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的AFPC人羊水祖細(xì)胞轉(zhuǎn)染PLV-hFIX-GFP質(zhì)粒72小時(shí)后，可見較弱的綠色熒光，96d后熒光明顯增強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)沒有變化仍維持成纖維樣(圖7E)，用胰酶消化后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞為54.91%(圖7B)，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)50%以上。通過流逝篩選出GFP陽性的細(xì)胞，經(jīng)含雙倍抗生素的培養(yǎng)液懸浮后移入6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。篩選出的細(xì)胞經(jīng)2代擴(kuò)增后，再次進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)有綠色熒光的細(xì)胞比例，綠色熒光陽性的細(xì)胞占95%以上(圖7D)，并且在24h內(nèi)貼壁，48h后進(jìn)入快速增長期。
2.6轉(zhuǎn)染后AFPC表達(dá)hFIX抗原濃度(hFIX:Ag)和hFIX活性(hFIX:C)為了檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的羊水祖細(xì)胞能否合成FIX并向外分泌，我們以每孔1×105的AFPC重新種植在24孔板繼續(xù)培養(yǎng)8d，分別在每2d換液時(shí)留取細(xì)胞培養(yǎng)上清液約100uL，-20℃冰箱保存，直到進(jìn)行檢測(cè)FIX:C和FIX:Ag。轉(zhuǎn)染后2d，AFPC已合成hFIX蛋白，在上清液中的濃度為20.77%±2.77%(圖8)，凝血活性16.42%±1.78%。FIX的合成在傳代后的第4天達(dá)到平臺(tái)期，為50.35%±5.42%，%此后第6天和第8天FIX濃度分別為51.10%±6.53%，54.23%±4.98%。轉(zhuǎn)染后的羊水細(xì)胞表達(dá)的hFIX蛋白的水平呈現(xiàn)基本穩(wěn)定趨勢(shì)，波動(dòng)幅度較小。我們還發(fā)現(xiàn)上清液中的FIX在凝血實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出凝血活性，并隨著濃度的升高而相應(yīng)增高，最高可達(dá)47.54%±3.24%(相對(duì)于正常人血清中FIX的活性)。
3討論
羊水中有來自胎兒皮膚、消化道、呼吸道和泌尿道等組織的脫落細(xì)胞，也有來自羊膜及早期胚胎組織的脫落細(xì)胞。其中具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞比例尚無統(tǒng)一的研究結(jié)論。Prusa等[11]報(bào)道羊水中表達(dá)OCT4的細(xì)胞約為0.1%−0.5%，DeCoppi等分選的CD117陽性細(xì)胞占原代細(xì)胞的1％。這些數(shù)據(jù)提示羊水中干細(xì)胞數(shù)目有限，如何對(duì)其進(jìn)行有效的分離和擴(kuò)增培養(yǎng)尤為重要。羊水細(xì)胞來源及成分復(fù)雜，不同來源的細(xì)胞貼壁、生長能力不同，因此培養(yǎng)條件在羊水干細(xì)胞的分離培養(yǎng)中起重要作用。本研究使用富含包括bFGF等各類生長因子的AmniomaxcompleteII，有利于羊水祖細(xì)胞貼壁生長，并通過機(jī)械刮下呈克隆生長的梭形細(xì)胞，成功地分離得到形態(tài)均一的羊水祖細(xì)胞，并對(duì)其生物學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)分離得到的羊水祖細(xì)胞來源于常規(guī)孕中期產(chǎn)前診斷時(shí)剩余的羊水標(biāo)本，與ESCs相比，不會(huì)破壞胚胎組織，因此避免了ESCs的倫理問題；與BM-hMSCs相比，AFPC標(biāo)本獲取是在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺得到的，創(chuàng)傷較小，而且AFPC在較長時(shí)間內(nèi)維持自我更新和復(fù)制的能力，P10代的生長速度較P3代僅略有下降，與Sayago等報(bào)道的相一致。同時(shí)我們得到的AFPC還能保持穩(wěn)定的生物學(xué)特性：第3代和第10代AFPC形態(tài)上沒有明顯的區(qū)別。有人報(bào)道，與骨髓和臍血的hMSCs(第4代)中的端粒酶長度相比，第6代人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的端粒酶長度明顯長。
這一發(fā)現(xiàn)也表明了羊水來源的干/祖細(xì)胞比成體的hMSCs有較高的增殖能力，可能是由于AFDC是來源于胚胎早期，更接近ESCs。研究表明人類ES細(xì)胞中至少有353個(gè)靶基因是OCT4、SOX2和NANOG三者共同擁有的，且3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在這些基因啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)都相互接近。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AFPC能夠在mRNA分子水平同時(shí)表達(dá)這3個(gè)與胚胎干細(xì)胞相關(guān)的分子。與胚胎干細(xì)胞相比，OCT-4的表達(dá)量較低，但有趣的是我們分離得到的羊水祖細(xì)胞表達(dá)的NANOGmRNA和SOX2mRNA的水平比ESCs還高。大量研究表明，OCT4、NANOG這兩個(gè)同源異型域基因是體內(nèi)外維持干細(xì)胞自我更新和保持未分化狀態(tài)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。OCT4的表達(dá)水平需維持在一定的水平，如果OCT4過表達(dá)，將使胚胎干細(xì)胞向內(nèi)胚層細(xì)胞分化，而NANOG的高表達(dá)可使人類胚胎干細(xì)胞不需要滋養(yǎng)層細(xì)胞就可維持干性。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)SOX2的胎兒組織將發(fā)育為含有表達(dá)SOX2的成體干細(xì)胞的組織，在胃、食管道、睪丸、子宮頸、肛門和眼睛晶狀體等組織特異性成體細(xì)胞群體中表達(dá)，并能夠更新它們的群體，必要時(shí)在特定組織中產(chǎn)生完全分化的細(xì)胞。這些現(xiàn)象表明SOX2似乎是一種在所有發(fā)育階段：胚胎、胎兒和成體干細(xì)胞中表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。本實(shí)驗(yàn)中分離得到的AFPC在mRNA水平同時(shí)表達(dá)OCT4，NANOG，SOX2這三個(gè)關(guān)鍵基因，其中NANOG和SOX2的表達(dá)水平較高，因此羊水祖細(xì)胞可能是介于胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞之間的一種細(xì)胞。為了觀察羊水祖細(xì)胞能否應(yīng)用于血友病B的基因治療，我們通過慢病毒載體同時(shí)轉(zhuǎn)入目的基因FIX-cDNA和報(bào)告基因GFP。本文使用的hFIXcDNA來自肝臟表達(dá)文庫，同時(shí)克隆hFIX基因內(nèi)含子的部分序列，置于hFIX之前，具有高效表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)。hFIX作為人體血漿中重要的凝血因子，正常情況下由肝細(xì)胞合成。
最初在肝臟中生成的hFIX是一種酶原，經(jīng)過在第157位和167位門冬氨酸部位的糖基化。N端12個(gè)谷氨酸的羧基化，以及在肽鏈中Arg45-Ala和Ar180-vaJ處精氨酰氨鍵的斷裂，剪除146−180位共35個(gè)氨基酸的肽鏈，生成一條由145個(gè)氨基酸構(gòu)成的輕鏈和另一條由236個(gè)氨基酸構(gòu)成的重鏈，并通過二硫鍵連接起來，最終形成具有絲氨酸蛋白酶活性的活化hFlX。慢病毒載體可以把人凝血因子IX(hFIX)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到羊水祖細(xì)胞，并且體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FIX能夠在羊水祖細(xì)胞內(nèi)合成并分泌到上清液中，而該蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)基本穩(wěn)定趨勢(shì)，波動(dòng)幅度較小，上清液中的濃度在第4天能達(dá)到平臺(tái)期。檢測(cè)到的FIX凝血活性也與其蛋白濃度呈正相關(guān)因此，在體外的培養(yǎng)系統(tǒng)中，羊水祖細(xì)胞不僅能夠合成hFIX，而且能正確剪切及修飾該蛋白，使其具有正常的凝血功能。轉(zhuǎn)染了hFIX的羊水祖細(xì)胞在體外能持續(xù)合成有凝血功能的hFIX蛋白，同時(shí)保持原有的形態(tài)和增殖速度，為基因治療提供了一種新型載體，羊水祖細(xì)胞可能成為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞以外更好的、合適的細(xì)胞來源之一。為血友病B產(chǎn)前治療的新方法提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
作者：楊辰敏范書玥唐匯祥鞏芷娟龔秀麗任兆瑞曾凡一單位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院婦產(chǎn)科上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院發(fā)育生物學(xué)研究室上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)胚胎分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及上海市胚胎與生殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室