環境微生物抗生素及重金屬抗性研究范文

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摘要：長期以來，因抗生素和重金屬藥物的過度使用，致使微生物產生耐藥性，耐藥細菌的蔓延已成為全人類的重大公共衛生安全議題。人們對微生物的抗生素抗性、重金屬抗性進行了大量研究。綜述了目前微生物抗生素抗性、重金屬抗性以及抗生素與重金屬協同抗性方面的研究進展，重點論述了微生物重金屬抗性的分子機制。結合課題組相關研究進展對未來研究進行了展望，以期為現有抗性微生物所致危害的減輕和未來抗性相關研究的深入提供參考。

關鍵詞：抗生素；重金屬；抗性；抗生素抗性基因；共選擇

引言

隨著人們生活水平的日益提高，環境問題逐漸成為人們關注的焦點，因藥物濫用引起的微生物耐藥性越來越受到人們的關注。抗生素是目前使用量最多、應用面最廣泛的藥物，被使用的抗生素，高達75％被人體和動物排出，最終進入環境。環境中抗生素的殘留，使一些微生物產生耐藥性，甚至引發了超級細菌的產生，如MRSA，VRE，E.coliNDM-1等，它們能抵抗多種抗生素，E.coliNDM-1甚至是無藥可醫[1]。除抗生素外，一些金屬離子也被廣泛應用于醫藥和其他領域中，如Ag，Sb，Bi等金屬化合物用于感染、寄生蟲、潰瘍等治療[2]，Cu，Zn，Cd，As等金屬化合物用作生長促進劑、殺菌劑、除草劑和抗菌劑等[3]。金屬元素 的開發與利用導致環境中出現了重金屬累積，因化學性質穩定，在環境中不易降解，更易使微生物產生抗性。抗生素和抗菌金屬的復合作用致使一些微生物出現了雙重抗性，如魚、蝦體內及沉積物中分離的氣單胞菌屬(Aeromonasspp.)[4]，醫院分離的傷寒沙門菌(SalmonellaentericaserovarTyphimurium)[5]、洋蔥伯克氏菌(Burkholderiacepacia)[6]等，給環境和人類健康帶來了巨大的威脅。基因型決定著表型，因抗性基因可在不同細菌間轉移、傳播和自我擴增的生物學特性，給人類健康帶來了巨大的潛在威脅[7]。綜合已有研究，結合抗生素與重金屬抗性研究進展，本文重點對微生物金屬抗性的分子機制進行論述，以期為有效減緩微生物耐藥性的發展及抗性元件在環境中的擴散作出貢獻。

1.微生物抗生素抗性的研究進展

自1937年第一批磺胺類藥物問世以來，即出現了磺胺抗性的相關報道，隨后陸續發現多種抗性細菌[8]。總結2000年之前一百多年間幾個不同時期微生物的耐藥性，發現隨著抗生素的使用，微生物的耐藥種類、耐藥率呈現出顯著遞增的趨勢[9]。近年來新型抗生素的發現和開發速度持續下降，而抗生素抗性基因(AntibioticResistanceGenes，ARGs)卻快速出現和擴散，如英國某奶牛場的126株大腸桿菌中存在著blaCTX-M，blaTEM和blaOXA基因，控制著超廣譜β-內酰胺酶（ESBL）的產生[10]；巴西南部農場的135株大腸桿菌中，檢測到了基因blaCMY-M2、blaTEM-1和qnrS存在[11]；2016年來自中國動物的大腸桿菌（EscherichiacoliSHP45）mcr-1基因的報道[12]，預示著最后一道抗生素防線多粘菌素將失去作用。ARGs的出現和擴散極大地影響了抗生素的治療效果，威脅著人類的健康，質粒、整合子、轉座子這些抗性基因的主要攜帶者加速了抗性基因在不同微生物間轉移和傳播，質粒的自我轉移性、int1和int2整合子中耐藥基因盒的存在使它們成為了抗性基因的主要傳遞者[13]。

2.微生物重金屬抗性的研究進展

自1960年人類從外傷病人的傷口分離出抗Hg金黃色葡萄球菌[14]以來，人類就開始了對微生物金屬抗性機制的研究。到目前為止，人們有關微生物的Hg，Cu，Ag，As，Zn等金屬的抗性機制進行了大量的研究。對耐Hg細菌研究表明，微生物可將Hg2+轉化成不溶性的Hg，其在室溫下可作為蒸氣從細菌細胞中揮發出來[15]。據DAS等[16]所述，窄譜mer操縱子和廣譜mer操縱子調控著耐Hg細菌對Hg的揮發。窄譜mer操縱子賦予細菌對無機Hg的抗性，Hg2+與細菌細胞周質空間的MerP結合，MerP將其轉運至質膜的MerT上，MerT上的Hg2+通過與跨膜螺旋上的半胱氨酸結合而進入細胞內，在細胞內被merA編碼的Hg還原酶還原為Hg0，MerR調控Hg抗性結構基因的表達，MerD起到二次調節的作用。另一個位于merA基因上游的Hg2+轉運體merH，通過與半胱氨酸殘基結合轉運Hg2+并能與merA本身共表達。廣譜mer操縱子除包含與窄譜操縱子相似的基因外，還存在其他基因，如merB基因編碼的有機Hg（R-Hg）裂解酶裂解C-Hg鍵，Hg2+被還原為Hg0。近年來的研究發現merB基因僅存在于少數的耐Hg細菌中[17-18]，表明R-Hg對大多數細菌仍存在著抑制、殺傷作用。細菌細胞具有控制正常Cu含量的系統，以抵抗高水平的Cu對其帶來的毒害作用。據HOBMAN等[19]所述，4個系統維持著腸桿菌科細菌的Cu穩態，即cus，cue，pco和cop。Cus系統中基因cusR和cusS調節基因簇cusCFBA的表達，表達后的CusCFBA蛋白質控制細胞內Cu2+的流出與細胞外H+的流入，但該系統僅在好氧條件下賦予細菌在中低等Cu水平的抗性。Cue，cop系統是調節大腸桿菌Cu抗性的主要機制，系統中cueO基因編碼氧化Cu+的多Cu氧化酶將Cu+氧化為毒性較小的Cu2+，再通過copA基因編碼的P型ATP酶驅動Cu外排系統將細胞質中的Cu排出細胞。Pco系統中含有多個pco基因簇，作為補充為大腸桿菌提供進一步的Cu抗性。除上述提到的一些銅抗性基因，細菌中還存在著copB，copC，copD，cueR，cutC，cutF等基因[20]，賦予其Cu抗性。NEUBERT等[20]發現銅分子伴侶CupA可促進Cu2+還原成Cu1+，進而促進銅的減少。Ag抗性由細菌中的sil基因座（silPGABFCRSE）賦予，基因座中的3個轉錄單位（silCFBAGP，silRS，silE）由不同的啟動子表達并相互作用，形成ATPase外排泵，將Ag+泵出細胞外，從而賦予細菌Ag抗性[21]。通過序列分析與定點誘變發現SilE上含組氨酸與甲硫氨酸的基序可促進SilE與Ag+的結合，使SilE類似于一個吸收Ag+的“分子海綿”[22]。SAEB等[20]發現一些細菌中oprB，oprM和cusC_1基因編碼的CusC蛋白所決定的外排泵系統可同時賦予細菌Cu/Ag抗性。As抗性一般由ars操縱子調控，arsC編碼的As還原酶還原As5+為As3+，隨后arsB編碼的亞As酸鹽逆向轉運蛋白ArsB或ArsAB將As3+排出；一些細菌還可通過arsM編碼的甲基轉移酶ArsM使甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉移至As3+，隨后被揮發或被甲基As酸鹽轉運蛋白ArsP排出；某些細菌體內還存在著gapdh和arsJ組成的雙基因系統，通過gapdh調控的生化反應和ArsJ的外排作用賦予對V價R-As的抗性[23]。Zn抗性被認為是由Zn進入和Zn外排泵的組合系統控制，如ZntA，ZntB等[24]。LU等[25]研究發現ZntA不僅參與細菌的Zn穩態，還能傳輸非生理性底物Cd和Pb，還發現存在于苜蓿中華根瘤菌（SinorhizobiummelilotiCCNWSX0020）中編碼Cu+/Ag+轉運蛋白的一個基因copA1b，對Cu抗性沒有任何貢獻，卻有助于Zn，Cd和Pb的耐受性。Cd，Cr，Pb，Ni等金屬相對來說使用量較少，微生物相關的抗性機制研究也相對較少，據DAS等所述[16]，也是由相關的操縱子與基因賦予。如Cd抗性由質粒攜帶的cad操縱子和czc操縱子調控，Pb抗性由pbr操縱子賦予，Cr抗性由chrA基因編碼的Cr酸鹽外排蛋白控制，Ni抗性由cnrYHXCBAT基因系統編碼的cnrCBA外排泵介導。CABRAL等[26]對巴西紅樹林沉積物中的微生物群落進行宏基因組與轉錄組分析時，鑒定出編碼Zn，Cd，Co抗性蛋白的基因czcR，czcD，czcB，czcC和czcA以及陽離子外排系統蛋白cusA基因。由上可見，人們對微生物金屬抗性機制的研究已經取得了很大進步，但仍需進一步探究與微生物金屬抗性相關的基因以及機制，以期從分子角度為醫學及環境污染問題提供解決方案。

3.微生物抗生素抗性與重金屬抗性的協同選擇研究進展

人們最初研究微生物對金屬Hg的抗性時，發現含有質粒R100的微生物具有Hg抗性的同時，還對鏈霉素、四環素、磺胺和氯霉素有抗性[27]。隨后人們陸續發現一些大腸桿菌具有類似的抗性[28]。如今越來越多的具有重金屬和抗生素協同抗性的細菌被篩選出來[4-6]。根據研究者對現有抗性機制的解析結果，協同抗性、交叉抵制、協同調控和生物膜的誘導4類機制控制著微生物的多重耐藥性[29]。近年來，人們還發現在重金屬殘留地區，ARGs的水平會隨著重金屬污染水平的增加而增加。如GAO等[30]研究環境中殘留的抗生素和重金屬對城市污水中紅霉素抗性基因（ERY-ARGs）的影響時，發現ere（A），ere（B），erm（B）等ERY-ARGs豐度與Zn殘留水平呈現出顯著的正相關；ZHOU等[31]在研究重金屬的選擇對ARGs的流行與傳播時，發現ARGs的數量與重金屬的總濃度具有正相關性；ZHANG等[32]研究垃圾滲濾液處理廠及周圍土壤和地表水中ARGs發生時，發現sul2基因與Zn，Cr呈顯著的正相關，同時還發現int1的豐度與金屬Zn，Ni，Cr也具有顯著的正相關性。現階段仍需進一步探究重金屬水平對ARGs豐度的影響，以評估ARGs對環境和人類可能帶來的威脅。

4.微生物抗性的未來研究展望

微生物的抗生素抗性、重金屬抗性以及抗生素與重金屬的協同抗性已經成為了威脅人類、動植物和環境的全球性問題。醫藥、農業、畜牧業領域中抗生素與重金屬藥物的合理使用，環境中抗生素與重金屬的殘留累積是目前環境治理的重中之重，它不是某個組織、某個國家的問題，應是全人類為之奮斗并解決的問題。本課題組于近期對某城市污水河道中的大腸桿菌抗生素耐藥性進行了分析，結果顯示檢測的17種抗生素中，69.1%的分離株對其中的1~13種抗生素具有抗性（結果另文發表）。與2013，2014年對該流域的大腸桿菌抗生素抗性檢測結果[33]比較，顯示目前的大腸桿菌對11種抗生素抗性呈現大幅度的下降，表明抗生素的減量使用及污水河道治理對微生物的耐藥性存在著顯著的消減作用。盡管已有大量研究報道了金屬壓力可以增加微生物的抗生素抗性，但其中僅少數研究確定了一些重金屬的濃度水平與某些抗生素抗性的關聯，本課題組檢測了上述污水河道大腸桿菌對Cu，Hg，Ag，Zn這4種重金屬的抗性，結果顯示大多數的分離菌株對4種重金屬無抗性，僅少數的分離菌株對Ag和Hg呈現出較弱程度的抗性（結果另文發表），抗生素和金屬表型數據未呈現顯著關聯。到目前為止大多數的研究仍缺乏金屬抗性與抗生素抗性表型及基因型對應關系的數據，這方面研究亟待加強。同時需進一步研究和了解水平遺傳元件（質粒、整合子和轉座子）的性質，進一步開展環境中抗性基因和多重抗性污染水平的研究，為更加有效地遏制抗性基因在環境中的擴散，評估復合污染和多重抗性帶來的生態風險與公共健康威脅提供理論依據。

【參考文獻】

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[33]徐國峰.碳青霉烯不敏感大腸桿菌分子特征及NDM-1適應性代價研究[D].哈爾濱:東北農業大學,2015.

作者：王小壘 李鳳姿 何家樂 劉言 楊洪巖 單位：東北林業大學