細胞通透性銅離子熒光探針研究范文

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《Chemical Journal of Chinese Universities》2016年第11期

摘要：

分別以羅丹明B和羅丹明6G為熒光信號報告基團，以增強水溶性為目的的羥乙基肼為修飾基團，合成了反應型的Cu2+離子選擇性熒光探針分子L1和L2．紫外光譜和熒光光譜等分析結果表明，探針分子L1和L2對Cu2+離子具有高靈敏度、高選擇性的光譜識別行為．探針分子對Cu2+離子的識別過程是通過Cu2+離子催化水解控制氧雜蒽熒光信號的螺環酰肼基團實現熒光信號的開啟，從而達到識別檢測Cu2+離子的目的，對Cu2+離子的檢出限均可達到10－8mol/L量級．同時，探針分子對常見金屬離子和銨離子均具有較強的抗干擾能力．由于羥乙基肼的引入增強了探針的水溶性，使得探針L1和L2具有良好的細胞通透性和低毒性，實現了其對β-胰島細胞(INS-1細胞)中Cu2+離子的熒光成像檢測．

關鍵詞：

羅丹明;酰肼;二價銅離子;熒光探針;熒光成像銅

在生物體和自然界中都是不可或缺的重要過渡金屬元素．在生物體內，Cu2+離子作為金屬酶和轉錄過程中重要的輔助因子參與了很多重要的生理過程［1］;在自然界中，銅是人類最早使用的金屬之一，環境中常?？梢詸z測出Cu2+離子的存在．然而，過量存在的Cu2+離子對生物體和環境均有不利影響［2，3］．諸多神經退行性疾病，如阿爾茲海默病［4］、帕金森?。?］及威爾森?。?］等都與人體中存在過量的Cu2+離子所導致的氧化應激和神經紊亂有關;而Cu2+離子對環境中水的污染也很嚴重，飲用水中如含有過量的Cu2+離子會引起人胃腸功能紊亂和肝腎功能損傷［7］;同時，在自然環境中存在的高濃度Cu2+離子會損害海洋、河流的自凈能力［8］．因此，監控生物體內和環境載體中Cu2+離子的濃度十分必要．熒光檢測方法具有響應快速、靈敏度高和探針易制備［9，10］等優點，基于熒光檢測方法的Cu2+離子探針的研究近年來備受關注．已報道的Cu2+離子熒光探針主要基于2種化學作用機制:Cu2+離子與探針配位形成配合物［11～14］，或Cu2+離子引發探針發生一些特殊的化學反應［15～17］．由于Cu2+離子自身的順磁性特點［18，19］，通過探針分子與Cu2+離子配位進行Cu2+離子檢測的方法往往會引起探針的熒光信號猝滅［20～22］，從檢測靈敏度角度考慮，猝滅型的熒光檢測并不是分析檢測的最佳方式．同時，由Irving-Williams序列規則可知，通過配位作用識別Cu2+離子的熒光探針容易被其它等電荷過渡金屬離子如Mn2+，Fe2+，Co2+和Ni2+等離子干擾．因此，設計由Cu2+離子引發探針發生特定的化學反應而引起紫外或熒光光譜信號發生變化的Cu2+離子熒光探針已成為近年來的研究熱點．這類由Cu2+離子引發化學反應的熒光探針往往會表現出熒光增強的效果［23～26］，有助于消除其它過渡金屬離子造成的干擾．其中，具有內酰肼螺環結構的羅丹明類染料［27～29］就是一類典型的反應型熒光探針．在氧雜蒽的π共軛體系中引入一個特殊的化學鍵形成內酰肼，使熒光信號報告基團的π共軛體系處于不發光的非共軛狀態;當探針分子與Cu2+離子發生作用時，Cu2+離子可引發反應斷開該化學鍵，開啟共軛體系，恢復羅丹明熒光團的發光性能，從而達到檢測Cu2+離子的目的．本文基于Cu2+離子可促進α-氨基酸酯水解和Cu2+離子可對羅丹明螺環內酰胺水解的機制［27，30，31］，分別以羅丹明B和羅丹明6G為熒光信號報告基團，設計合成了以羥乙基肼增強水溶性的Cu2+離子選擇性反應型螺環酰肼熒光探針分子L1和L2．實驗結果表明，引入2-羥乙基官能團不但增強了探針的水溶性并保持了其肼類衍生物的識別性能，還表現出良好的細胞穿透能力及低毒性等性能，可實現活細胞中Cu2+離子的熒光成像檢測．

1實驗部分

1．1試劑與儀器

羅丹明B和羅丹明6G購自上海晶純試劑有限公司;丙酮酸鈉購自天津科密歐化學試劑有限公司;2-羥乙基肼購自韶遠科技有限公司;濃硫酸、碳酸氫鈉、氯化鈉、二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、β-巰基乙醇、磷酸氫鈉(PBS)緩沖液、二甲基亞砜和硅膠(100～200目)均購自天津恒山化工科技有限公司;光譜分析所用水為二次蒸餾水，無熒光雜質．RY-2型熔點儀(天津市分析儀器廠);BrukerAVANCEⅢ型核磁共振波譜儀(1HNMR，400MHz，TMS為內標，CDCl3為溶劑);UV-2550型紫外-可見(UV-Vis)分光光度計(日本Shimadzu公司);F-4600型熒光光譜儀(日本Hitachi公司);ZAB-HS型質譜儀(英國VG公司);FV-1000型激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)．

1．2探針分子的合成

探針分子L1和L2的合成路線如Scheme1所示．探針分子L1的合成:稱取1.82g(4.1mmol)羅丹明B置于100mL圓底燒瓶中，加入15mL甲醇溶解．在攪拌下緩慢滴入4mL濃H2SO4，回流36h．將反應混合物倒入100mL水中，用碳酸氫鈉中和至中性，用二氯甲烷萃取(100mL×3)，分離出的有機相用飽和食鹽水洗滌(50mL×2)，收集有機相并干燥，得到1.98g粗產品1，粗產品1未經純化直接用于下一步反應．稱取262.8mg(0.533mmol)粗產品1置于25mL圓底燒瓶中，加入5mL甲醇和250μL2-羥乙基肼(2)，在氬氣氣氛中加熱回流52h．旋轉蒸干溶劑后，固體混合物經柱色譜分離［V(SiO2)∶V(CH2Cl2/CH3COOC2H5)=5∶3］，得到107mg紫色固體化合物L1，產率41%，m．p．190～192℃．1HNMR(400MHz，CDCl3)(圖S1，見本文支持信息)，δ:7.92(d，J=8Hz，1H)，7.53～7.47(m，2H)，7.14(d，J=8Hz，1H)，6.45～6.40(m，4H)，6.26(d，J=12Hz，2H)，3.33(q，J=6.7Hz，10H)，2.45(s，2H)，1.16(t，J=8Hz，12H);13CNMR(100MHz，CDCl3)(圖S2，見本文支持信息)，δ:168.3，153.9，151.5，149.0，133.1，130.0，128.5，124.2，123.0，108.0，105.3，98.0，66.4，58.8，52.8，44.5，29.8，12.7;HRMS，m/z:501.2862［M+H］+．探針分子L2的合成:稱取200mg(0.452mmol)羅丹明6G置于50mL圓底燒瓶中，加入5mL無水乙醇，再加入200μL2-羥乙基肼(2)，加熱回流反應72h，然后旋轉蒸干溶劑，所得粗產物在乙醇中重結晶，得到122.9mg粉紅色晶體L2，產率58%，m．p．273～275℃;1HNMR(400MHz，CDCl3)，δ:7.95～7.93(m，1H)，7.52～7.50(m，2H)，7.11～7.09(m，1H)，6.38(s，2H)，6.20(s，2H)，3.32(bs，2H)，3.21(q，J=8Hz，4H)，2.42(bs，2H)，1.90(s，6H)，1.32(t，J=6Hz，6H);13CNMR(100MHz，CDCl3)(圖S4，見本文支持信息)，δ:168.2，152.3，151.7，147.7，133.2，129.9，128.5，128.1，124.1，123.1，117.9，105.7，96.8，66.4，58.7，52.7，38.5，16.8，14.8;HRMS，m/z:473.2560［M+H］+．1．3溶液的配制實驗所用分析溶液是將一定體積的探針分子濃溶液(1×10－2mol/L，DMF)與相應體積各種金屬離子的水溶液(1×10－2mol/L)混合，再用乙腈/水混合溶劑(體積比1∶5)稀釋，將分析溶液體系定容到3mL．在室溫下，將上述分析溶液搖勻并靜置10min后測定光譜數據．1．4細胞的熒光成像實驗選用細胞為β-胰島細胞(INS-1細胞)，培養基為RPMI1640培養基，其中加入10%血清、5×10－5mol/L的β-巰基乙醇、1×10－6mol/L丙酮酸和500μL雙抗．先將探針分子溶于DMSO中，取一定量該溶液加入到含有培養好的INS-1細胞的培養板中，最終濃度為2×10－7mol/L，再置于細胞培養箱中孵育30min，用PBS緩沖液漂洗3次，然后用倒置熒光顯微鏡觀察;再加入Cu2+離子的水溶液，使其最終濃度為2×10－6mol/L，在培養箱中孵育30min，最后用激光共聚焦顯微鏡觀察．

2結果與討論

2．1紫外-可見光譜分析

采用紫外-可見光譜研究了2種探針分子與Cu2+離子的相互作用．在乙腈/水混合溶劑(體積比1∶5)中，探針分子L1和L2在400～700nm的可見光譜區間基本沒有吸收(見圖1)．當加入5倍濃度的Cu2+離子后，紫外-可見光譜分別在553和521nm處出現吸光度值的顯著增強，且溶液顏色發生明顯變化，從無色變為橘色(L1)或粉紅色(L2)．這種現象表明2種探針分子均與Cu2+離子發生了識別作用，誘導了探針分子的羅丹明內酰肼螺環結構開啟，摩爾吸光系數分別提高到εL1=7.17×104L•mol－1•cm－1和εL2=8.71×104L•mol－1•cm－1．另外，還考察了其它過渡金屬離子、堿金屬離子和堿土金屬離子與探針分子之間的相互作用．如圖1中插圖所示，在分別加入5倍濃度的Ag+，Al3+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr3+，Fe2+，Fe3+，Hg2+，K+，Mg2+，Na+，NH+4，Ni2+，Pb2+和Zn2+離子溶液后，除了Hg2+離子可引起探針分子L1和L2有較微弱的吸收增強(＜10%)之外，其它離子均未引起探針分子在該波長下的明顯吸收變化;而且溶液顏色未發生明顯變化．因此，探針分子L1和L2可作為比色傳感的Cu2+離子探針使用．

2．2熒光光譜性質

在相同的乙腈/水混合溶劑體系中，采用熒光光譜考察了探針分子L1和L2對上述不同金屬陽離子的熒光光譜識別行為．由圖2可見，探針分子L1(1×10－6mol/L)在520nm激發時，自身的熒光背景很弱，熒光發射強度僅為5.3a．u．，而探針分子L2在500nm激發時，其熒光強度為46.3a．u．．當向2種探針溶液中加入5倍濃度的Cu2+離子后，發現探針分子L2的熒光開啟變化非常顯著，熒光強度可達到4158a．u．，而探針L1的熒光強度只有651a．u．．這說明探針分子L1不管在內酰肼螺環關閉還是開啟的情況下，都比探針分子L2的相應體系測得的熒光強度要低，即熒光量子產率低．這種現象可以解釋為，探針分子L1中N上的雙烷基取代使其具有更好的給電子能力，可引發L1分子內的光誘導電子轉移(PET作用)［32］，導致熒光效率降低．但是，在比較同一探針加入Cu2+離子前后的熒光強度比時發現，探針分子L1的熒光強度增大倍數(122倍)是探針分子L2增大倍數(90倍)的1.4倍．這說明雖然加入Cu2+離子后，L1開啟的熒光強度并不高，但是由于探針分子L1自身較低的熒光背景，使其在Cu2+離子識別過程中仍具有較高的靈敏度．同時，還研究了探針分子L1和L2與其它離子(Ag+，Al3+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr3+，Fe2+，Fe3+，Hg2+，K+，Mg2+，Na+，NH+4，Ni2+，Pb2+和Zn2+)的相互作用，可以看出除了L2對Hg2和Cr3+離子有微弱的熒光增強外，其它離子均未發現明顯的熒光變化，說明探針L1和L2對Cu2+離子都是具有高靈敏度和高選擇性的化學傳感體系．為了進一步考察探針分子對Cu2+離子識別時熒光強度變化與Cu2+離子濃度之間的關系，進行了2種探針分子與不同濃度的Cu2+離子熒光光譜連續滴定實驗，結果見圖3和圖S5(見本文支持信息)．在滴定過程中，隨著Cu2+離子濃度的不斷增大，探針分子與Cu2+離子反應后的熒光光譜在580nm(L1)和550nm(L2)處逐漸增強．Cu2+離子濃度增量分別達到15倍(L1)和13倍(L2)時，識別體系的熒光強度接近飽和．而且連續滴定的熒光光譜數據很好地符合了Sigmoidal擬合曲線，從而計算出探針分子L1和L2對Cu2+離子的熒光“開啟”常數K(L1－turn-on)=2.08μmol/L(R2=0.9998)，K(L2－turn-on)=2.6μmol/L(R2=0.9991)［33］．另一方面，在低濃度Cu2+離子區域，熒光變化與Cu2+離子濃度呈現線性關系(圖S6，見本文支持信息)，利用三倍標準差法，推測出探針分子對Cu2+離子的檢出限分別為8.4×10－9mol/L(L1)和1.0×10－8mol/L(L2)，該檢出限遠低于美國環境保護署(EPA)對飲用水中Cu2+離子安全線規定(2×10－5mol/L)［34］的要求，表明2種探針分子都可開發作為飲用水和工業排放廢水中Cu2+離子檢測或監控的熒光探針．

2．3競爭離子和pH值對體系的干擾

為了考察探針在實際復雜環境下對Cu2+離子的選擇性響應，進行了競爭離子的干擾實驗．實驗結果(圖4)表明，在5倍濃度的競爭金屬離子(Ag+，Al3+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr3+，Fe2+，Fe3+，Hg2+，K+，Mg2+，Na+，NH+4，Ni2+，Pb2+和Zn2+)存在下，探針分子仍可與5倍濃度的Cu2+離子發生較穩定的熒光開啟行為．如圖4所示，除了Ag+(對L1)，Ni2+和Co2+(對L2)離子對探針分子的干擾達到約15%以外，其余離子的存在均對探針分子L1和L2的熒光識別體系的影響較小，它們之間變化差值均在12%以內．這說明2種探針分子的抗離子干擾能力都較強，是實際環境檢測中良好的Cu2+離子識別探針．此外，還考察了不同pH體系對探針分子離子識別的影響．由圖5可見，在未加入Cu2+離子時，探針分子L1和L2在pH=5～12范圍內熒光強度基本保持不變;而在加入5倍濃度的Cu2+離子后，探針分子L1和L2在pH=6～8范圍內都能保持相對穩定的熒光變化，說明它們在此范圍內對體系pH變化不敏感．以上結果表明，探針L1和L2可分別在弱酸至弱堿的環境下直接用于Cu2+離子的檢測．

2．4識別機理

通常情況下，羅丹明類染料形成的內酰肼螺環結構對銅離子的識別是通過Cu2+離子對探針分子結構中的內酰肼螺環結構進行水解，恢復氧雜蒽的π-共軛體系實現的［27］．由于探針分子L1和L2結構相似，本文以探針分子L1與Cu2+離子作用后的高分辨質譜為代表，說明2種探針分子的識別機理(圖S7，見本文支持信息)．探針分子L1在識別Cu2+離子時熒光行為開啟，表明Cu2+離子與羥乙基酰肼的NO2識別位點結合后，打開了探針分子L1中的螺環結構，隨著Cu2+離子進一步水解羥乙基酰肼，溶液變為以羅丹明B為主的體系．質譜中有明顯的羅丹明B產物分子的高分辨質譜峰(m/z443.2347)以及少量沒有發生水解反應的探針分子L1的質譜峰(m/z500.2738)．這些數據證實了Cu2+離子催化并水解機理的正確性．另外，為了進一步分析探針L1對Cu2+離子的識別模式，向含有探針分子L1(1×10－6mol/L)和Cu2+離子(1.5×10－5mol/L)體系中加入30倍濃度的S2－離子，發現熒光強度并沒有減弱(圖S8，見本文支持信息)，表明Cu2+離子和探針分子L1發生了不可逆的水解反應而非可逆的配位結合模式．

2．5細胞內Cu2+離子的熒光成像檢測

由于探針分子L1和L2對Cu2+離子具有高靈敏度的熒光開啟性能，同時它們又具有潛在的膜通透性(良好的水溶性)，因此利用激光共聚焦顯微鏡考察了2種探針分子對β-胰島細胞(INS-1細胞)中Cu2+離子的成像行為．從圖6和圖7可以看出，探針分子L1和L2能夠順利進入細胞對Cu2+離子進行成像．由圖6(A)可見，探針分子L1(2×10－7mol/L)和細胞共培養30min后，無死細胞出現，并且細胞Fig．6Brightfieldimages(A，D)，fluorescenceimagesandoverlayimages(C，F)ofINS-1cellsincubatedwithL1aswellasL1andCu2+(D—F)Excitationwavelength:559nm．形貌無明顯變化，說明L1毒性低，對細胞生長不產生影響．在559nm波長的激光激發下，并未觀察到明顯的熒光發射信號［圖6(B)和(C)］;相反，盡管在加入2×10－6mol/L的Cu2+離子孵育30min后細胞形貌無明顯變化［圖6(D)］，但在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到細胞中的部分區域呈現顯著紅色熒光信號［圖6(E)］．通過比較明場和暗場熒光重疊圖可以看出，強熒光信號發射主要集中在核周區的細胞質處中［圖6(F)］，該結果充分表明探針分子L1進入細胞后主要集中在細胞質中，可與進入細胞質中的Cu2+離子作用，將探針分子L1中的螺環內酰肼結構水解，恢復氧雜蒽的π共軛體系從而實現熒光信號開啟型檢測細胞質中的Cu2+離子．同樣，探針分子L2呈現與L1相同的熒光成像識別檢測行為(見圖7)，在488nm波長激光的激發下，加入Cu2+離子前，并未在細胞中觀察到明顯的熒光發射信號［圖7(B)和(C)］;加入Cu2+離子共培養后，L2在INS-1細胞的核周區呈現顯著的綠色熒光信號，表明探針L2進入細胞后主要分布在細胞質中［圖7(E)和(F)］．以上結果表明，探針分子L1和L2均具有良好的細胞通透性和低毒性，可作為細胞內Cu2+離子熒光成像檢測的熒光探針．

3結論

分別以羅丹明B和羅丹明6G為熒光信號報告基團，設計合成了以羥乙基肼增強水溶性的高靈敏度、高選擇性反應型Cu2+離子熒光探針L1和L2．通過Cu2+離子催化水解控制氧雜蒽熒光信號的螺環酰肼基團，探針L1和L2對Cu2+離子表現出獨特的熒光開啟型識別檢測行為和對常見離子的抗干擾能力，檢出限分別達到10－8mol/L和10－9mol/L量級，滿足環保部門對飲用水中Cu2+離子檢出限的要求．同時，由于探針具有良好的細胞穿透能力和低毒性，以L1和L2為熒光檢測探針實現了對β-胰島細胞(INS-1細胞)中Cu2+離子的熒光成像檢測．總之，L1和L2為高靈敏度、高選擇性反應型Cu2+離子熒光探針，具有開發為實際應用前景的銅離子熒光探針和活細胞中Cu2+離子熒光成像檢測探針的潛力．

作者:米小龍 焦曉潔 劉暢 何松 曾憲順 單位:天津理工大學材料科學與工程學院