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【摘要】目的建立HPLC測定西司他丁鈉的含量和有關物質。方法采用高效液相法色譜(HPLC法)，以C18柱(4.6mm×250mm，5μm)為分析柱，乙腈∶0.1mol/L磷酸銨(用磷酸調pH至6.8)(30∶70)為流動相，檢測波長210nm，流速0.8ml/min，柱溫50℃。結果西司他丁鈉在0.08～0.60mg/ml范圍內與峰面積有良好的線性關系，平均回收率為100.2%(n=9)。西司他丁鈉與相鄰雜質峰完全分離，西司他丁鈉的檢測限為1.8ng，定量限為5.9ng。結論該方法可靠、簡便、準確。可作為西司他丁鈉含量和有關物質的測定方法。

【關鍵詞】西司他丁鈉；高效液相色譜法；有關物質

ABSTRACTObjectiveToestablishanHPLCmethodforthedeterminationofthecontentandtherelatedsubstancesofcilastatinsodium.MethodThecolumn:C18(4.6mm×250mm,5μm)wasused,themobilephasewasacetonitrileand0.1mol/Lphosphateammonium(adjusttopH6.8withphosphoricacid)(30∶70),thedetectingwavelengthwas210nm,theflowratewas0.8ml/minandthecolumntemperaturewas50℃.ResultsTheaveragerecoverywas100.2%(n=9).Cilastatinsodiumncouldbecompletelyseparatedfromotherimpurities.Limitofdetectionforcilastatinsodiumwas1.8ng.Limitofquantitationforcilastatinsodiumwas5.9ng.ConclusionTheproposedHPLCmethodisreliable,convenientandaccurate.Themethodcanbeusedfordeterminationofcontentandrelatedsubstacesofcilastatinsodium.

KEYWORDSCilastatinsodium;Relatedsubstaces;HPLC

西司他丁鈉(cilastatinsodium，CS)是一種很好的腎去氫肽酶I抑制劑，其本身不具有抗菌活性，對β內酰胺酶也無抑制作用，它是碳青霉烯類藥物亞胺培南(imipenen，IMP)的增效劑。IMP單獨給藥時，經腎小球過濾或分泌后，被近端腎小管上皮細胞刷狀緣中的去氫肽酶I水解失活60%～95%，導致尿中活性藥物濃度降低。CS能阻抑IMP進入腎小管上皮組織，減少IMP的排泄并保護IMP在腎中不被破壞，可防止因IMP引起的腎小管壞死，減輕藥物的腎毒性，增加療效。兩者合用后西司他丁減少IMP被腎小管上皮細胞的去氫肽酶水解，可使IMP的AUC增加20%，在尿中回收的原形藥物多達70%，所以在制劑時IMP/CS以等量配制［1］。

IMP/CS適用于多種細菌的混合感染和需氧/厭氧菌的混合感染以及在尚未確定病原菌前的早期治療，近年廣泛用于抗感染治療，取得滿意結果，已成為治療嚴重感染的一線藥物。

對于原料CS的含量測定，國外藥典采用電位滴定法［2］，國內未見報道。本研究建立HPLC法測定CS含量和有關物質，得到滿意結果，現報道如下。

1儀器與試藥

島津LC2010A型高效液相色譜儀，Watersmillipore真空泵，SB5200型超聲波儀，F13型酸度計，島津MultiSpec1501紫外分光光度計。

CS原料3批(由某藥廠提供；批號20044006、20044007和20044008)；CS對照品(純度97.8%)由河北省藥品檢驗所提供；乙腈為色譜純，磷酸銨、磷酸二氫鉀、鹽酸、30%過氧化氫、氫氧化鈉均為分析純。

2方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：DiamondC18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：乙腈∶0.1mol/L磷酸銨(精密稱取磷酸銨20.31mg，加1000ml水使溶解并稀釋至刻度，用磷酸調至pH6.8)(30∶70)；流速0.8ml/min；檢測波長210nm；柱溫50℃；進樣量20μl，結果見圖1。

1：西司他丁鈉；2、3：未知雜質

圖1西司他丁鈉HPLC有關物質圖譜

2.2系統適用性

(1)柱效與不對稱度取CS對照品溶液進樣，理論塔板數按CS峰計算為7070。

(2)進樣精密度試驗取CS對照品溶液連續進樣5針，其峰面積的RSD為0.008%，表明系統精密度良好。

2.3專屬性

對CS對照品進行高溫、氧化、強酸、強堿的破壞性試驗，以研究其降解產物與主峰的分離情況。

在選定的色譜條件下，取上述破壞后供試品溶液進樣，結果主峰與各雜質峰獲得有效分離，提示氧化和強酸破壞產生較大雜質，高溫和強堿破壞總雜質量和雜質個數變化不大，表明CS在氧化、強酸條件下較不大穩定，強堿和高溫對樣品影響較小。

2.4

準確度

精密稱取CS對照品及已知含量的樣品各三份，分別置于100ml量瓶中加水溶解并稀釋至刻度，制成含量測定濃度的80%、100%和120%的溶液，搖勻，濾過，進樣，結果低、中、高3個濃度的回收率(n=3)分別為100.1%(RSD=0.28%)、100.8%(RSD=1.24%)和99.8%(RSD=0.53%)；平均回收率為100.2%(n=9)(表1)，表明方法準確度良好。表1回收率測定結果

2.5線性和范圍

精密稱定CS對照品，置25ml容量瓶中，加水使溶解，加至刻度，分別制成0.0793、0.1586、0.3172、0.4758和0.6344mg/ml對照品溶液按“2.1”項色譜條件進行測定，以對照品溶液濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，結果在0.08～0.60mg/ml的濃度范圍呈良好的線性，線性方程為：

y=5.178×107x-1.981×105r=0.9997

2.6方法精密度

同一批樣品，分別進樣6次，依法測定含量，結果含量的RSD為0.08%，表明方法精密度良好。

2.7檢測限和定量限

以信噪比≈3時，注入儀器的量確定CS的檢測限為1.8ng；以信噪比≈10時，確定CS的定量限為5.9ng。

2.8樣品溶液的穩定性

在同一批樣品的溶液，在0、1、2、3、4和5h分別進樣進行考察溶液的穩定性，測得峰面積的積分值，結果RSD為0.78%，表明在室溫(25℃)條件下，溶液放置6h，其主峰面積沒有變化，保留時間也基本沒有變化。因此，CS溶液穩定性好。

2.9重復性試驗

分別平行制備6份CS供試品溶液。在上述色譜條件下，分別進樣20μl，測得CS的含量。結果顯示RSD為0.58%，說明本實驗方法重復性好(表2)。

2.10有關物質的測定

原料測定溶液的制備精密稱取CS15mg，置25ml容量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml容量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

測定方法量取對照品20μl注入液相色譜儀中，調節檢測器靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的20%，再分別精密量取上述各溶液20μl，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖至20min(表3)。

表2重復性測定結果表3有關物質檢測結果

2.11含量測定

對照品溶液的制備精密稱定CS對照品適量，加水溶解并稀釋成每1ml中約含CS0.5mg的溶液，作為對照品溶液。

供試品溶液的制備取本品適量，精密稱定，加水制成每1ml中約含0.3mgCS的溶液，作為供試品溶液。

測定方法取CS原料3批，按上述方法制被測定溶液，各20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算CS含量，結果見表4。

取CS原料3批(同上)，用電位滴定法進行試驗，結果見表4。

3討論

(1)流動相的選擇CS的化學名為(Z)7［［(R)2氨基2羧乙基］硫］2［(S)2，2二甲基環丙烷甲酰氨基］2庚烯酸鈉。由于分子結構中含叔胺結構，它易表4含量測定結果與固定相表面殘余硅醇基形成氫鍵，發生次級保留效應，導致拖尾，故應在流動相中加入適當的添加劑，以限制硅醇基團對CS分子的作用。本文選用季胺類離子對試劑磷酸銨。磷酸銨與CS為同種電荷，在本色譜系統中，一方面與溶劑間存在靜電排斥力，另一方面作用于固定相表面，抑制溶劑的親硅醇基團效應，達到改善對稱性，提高柱效，縮短溶質保留時間。在本試驗中曾用0.1mol/L的磷酸溶液，但是同樣濃度下改善峰形的效果遠不如磷酸銨。在流動相中加入較低濃度的磷酸調節pH至6.8，有助于保持峰形的對稱性。在流動相的pH選擇上，曾用pH5.5、pH6.0，、H6.5以及pH6.8但都不及pH6.8，在此條件下，主峰保留時間縮短，柱效明顯增加。有機相選用30%的乙腈與磷酸銨混合，是用來加快CS的出峰時間，降低柱壓，提高柱效，改善主峰與雜質峰的分離度。

(2)檢測波長的選擇取CS對照品適量，用水溶解并稀釋至15μg/ml的溶液。在200～700nm波長范圍內掃描，結果CS在此范圍內無最大吸收波長，但考慮其邊緣效應，同時考慮到其基線噪音的穩定性，故選擇CS和雜質均有較高檢測靈敏度作為測定波長。

(3)柱溫的選擇分別將柱溫設為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃，結果顯示柱溫對分離影響不大，但升高柱溫可使系統平衡時間縮短，基線穩定性明顯改善，降低了流動相的粘度和柱壓，縮短了保留時間，提高柱效，適當改善峰形，使試驗結果重現性更好。

(4)與電位滴定方法的比較電位滴定法測定CS含量時，共有三個突躍點，計算采用第一和第三突躍之間的滴定數差值。但是它的第一個突躍很不顯著，影響結果的判定，也影響測定準確度。采用高效液相色譜法，簡單、快速且準確度高。

致謝：本文的實驗得到長治醫學院2002級學生張文波和宋鑫鑫兩位同學的大力協助。

【參考文獻】

［1

］張建民，馮玲玲，李勇，等.抗菌藥物增效劑［J］.中國藥師，2003，6(3)：172～173.

［2］TheUnitedStatesPharmacopoeialConventionInc.TheUnitedStatesPharmacopoeiaXXVIII［S］.TheBoardofTrustees,2005:471～472.新晨