扎那米韋長鏈酯衍生物1c體內外抗流感病毒活性范文

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【摘要】目的研究扎那米韋長鏈酯衍生物1c的體內外抗流感病毒活性。方法體外實驗以流感病毒感染的MDCK細胞為模型，以細胞病變為指標，研究了化合物1c的細胞毒性以及對4種流感病毒A型和3種流感病毒B型的抑制活性。體內實驗應用感染了流感病毒甲1(H1N1)亞型FM1株的小鼠動物模型，觀察不同給藥方案、不同劑量、不同給藥途徑的多項指標。結果在細胞培養內，化合物1c抑制流感病毒A型的IC50在0.23～26.86μmol/L之間；抑制流感病毒B型的IC50在21.79～246.80μmol/L之間。體內實驗中，應用不同給藥方案1c治療可以明顯改善FM1感染小鼠的存活率，平均生活日及肺指數。結論化合物1c有潛能開發為抗流感病毒藥物。

【關鍵詞】扎那米韋；衍生物；流感病毒

ABSTRACTObjectiveTotesttheantiinfluenzavirusactivitiesofazanamivirderivative1c.MethodsThecytotoxicitiesandantiviralactivitiesof1cinvitroonfourinfluenzavirusAstrainsandthreeinfluenzavirusBstrainsweretestedinMDCKcells.Theantiviralactivitiesof1cinvivoweretestedinthemiceinfectedwithinfluenzaAvirussubtypeFM1.ResultsIncellculture,theIC50sof1cforinfluenzavirusAstrainswere0.23to26.86μmol/L,andforinfluenzavirusBstrainswere21.79to246.80μmol/L.Invivo,1cdisplayedsignificanttherapeuticaleffectsonmiceinfectedwithinfluenzavirusAsubtypeFM1onsurvivalrates,survivaldaysandlungindexeswithdifferentmedications.ConclusionThenewcompound1cmaybeapotentialcandidatefornewantiviraldrugs.

KEYWORDSZanamivir;Derivative;Influenzavirus

流感是一種由流感病毒引起的急性病毒性呼吸道傳染病，每年都在全世界流行，其波及范圍很廣，造成的經濟損失嚴重，對公共衛生的威脅巨大［1，2］。盡管人們在分子和細胞水平對流感病毒的認識有了長足的進展，但是由于流感病毒抗原變異頻繁，疫苗效果不理想，藥物研發相對緩慢，所以流感病毒引起的死亡和損傷仍然是呼吸系統疾病中最為主要的［3～7］。目前人們已經發現的流感病毒藥物研發分子靶點有：血凝素、神經氨酸酶(neuraminidase，NA)、M2蛋白等，其中針對NA的研究最為廣泛和深入。通過在結構水平對酶活力的研究，可以研制出構效關系更明確、更加廣譜的抗病毒藥物［8～11］。FDA批準的兩個NA抑制劑藥物扎那米韋和oseltamivir就是明顯的例子。由于扎那米韋的口服生物利用度低，分布體積較小，尿清除速率過快，所以臨床應用受到限制，給藥途徑局限為吸入給藥［12］。一些實驗室研究了扎那米韋類似物的合成以及它們對流感病毒的抑制活性［13～15］。

本研究中，我們對劉宗英等合成的扎那米韋長鏈酯衍生物1c(結構式見圖1)進行了體內外抗流感病毒活性研究。在體外實驗中，我們以MDCK細胞為模型，研究了化合物1c的細胞毒性以及對4種A型和3種B型流感病毒的抑制活性，體內實驗以感染了流感病毒甲1(H1N1)亞型FM1株的小鼠為模型，評價化合物1c的體內抗病毒活性。

圖1化合物1c的結構式

1材料與方法

1.1材料

MDCK細胞由本室自行傳代培養。流感病毒A/粵防/243/72(H3N2)、流感病毒A/濟防/15/90(H3N2)、流感病毒A/京防/262/95(H1N1)、流感病毒A/漢防/359/95(H3N2)、流感病毒B/濟防/13/97、流感病毒B/京防/76/98、流感病毒B/四川/83/2000和流感病毒甲1(H1N1)亞型(FM1株，H1N1)鼠肺適應株均由本室提供。細胞培養液為含10%新生牛血清，0.3mg/ml谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的Eagles基礎培養液(MEM)。維持液為含10%白蛋白，0.3mg/ml谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的Eagles基礎培養液(MEM)。小鼠為昆明鼠，雌、雄各半，14～16g，購于中國醫學科學院實驗動物研究所。化合物1c和扎那米韋由本研究所合成室提供；利巴韋林(RBV)購自湖北省醫藥工業研究院。

1.2化合物1c對MDCK細胞毒性實驗

(1)細胞病變法(CPE法)將生長狀態良好的MDCK細胞，按每孔約2.5×104MDCK細胞接種到96孔培養板，每孔0.1ml，37℃，5%CO2培養箱培養24h，待細胞長成單層后進行實驗。加入含有不同濃度倍比稀釋的1c的維持液，共8個稀釋度，每濃度2孔，同法測定扎那米韋，同時設無藥物細胞對照。以觀察細胞病變為指標，顯微鏡下觀察細胞病變，75%～100%為4，50%～74%為3，25%～49%為2，1%～24%為1，無病變為0。計算每濃度藥液平均細胞病變程度，按Reed&Muench法計算半數有毒濃度CC50。

(2)四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)&

nbsp;按每孔約2.5×104MDCK細胞接種到96孔培養板，24h后待細胞長成單層后，棄去培養液，加入含有不同濃度倍比稀釋的1c的維持液，每個稀釋度重復3孔，置37℃，5%CO2培養箱，培養72h，棄上清，加入100μl維持液配制的MTT(0.5mg/ml)，37℃繼續培養4h，每孔加入100μl50%N，N二甲基甲酰胺(DMF)20%十二烷基磺酸鈉(SDS)脫色液，37℃過夜，在酶聯儀上測定波長為570nm的吸收值(A570)。每次實驗均設定細胞對照孔3孔，結果以公式(細胞對照A570-加藥細胞A570)/細胞對照A570，計算細胞死亡率(%)，并用ReedMuench法計算半數有毒濃度CC50，同法測定扎那米韋。

1.3化合物1c體外抗流感病毒活性實驗(CPE法)

按每孔約2.5×104MDCK細胞接種到96孔培養板，24h后待細胞長成單層后，棄去培養液，加入一定量的病毒，37℃吸附2h，然后棄病毒液，加無血清MEM洗板，加入含不同濃度化合物1c的維持液，每濃度3孔，37℃，5%CO2培養箱培養，待病毒對照組病變為4個加號時，觀察結果。75%～100%為4，50%～74%為3，25%～49%為2，1%～24%為1，無病變為0。實驗同時設細胞對照，病毒對照，陽性對照藥為扎那米韋。并用ReedMuench法計算半數有效濃度IC50(表1)。

1.4化合物1c小鼠體內抗流感病毒甲1(H1N1)亞型(FM1株)療效實驗

1.4.1預防+治療實驗采用流感病毒甲1(H1N1)亞型(FM1株)感染方法。除毒性對照組外，其余各實驗組小鼠均經乙醚麻醉，用加樣器經鼻滴入40μl一定量LD50的實驗病毒液。實驗時化合物1c用5%吐溫80配成一系列濃度的懸液，采取灌胃方式給藥。劑量為31.25、15.63及7.81mg/kg。感染當天在感染前4h灌胃給藥1次，感染后間隔4h再次給藥，每日2次，共5d。陽性藥物RBV采用腹腔注射50mg/kg，每日2次，共5d。病毒對照組采用給予同樣體積5%吐溫80表1化合物1c體外抗流感病毒活性溶液灌胃給藥，每日2次，共5d。按所有給藥方式的最高劑量另設藥物毒性對照組。實驗同時滴定病毒LD50。

1.4.2治療實驗本次實驗感染流感病毒甲1(H1N1)亞型(FM1株)的方法同上。實驗時化合物1c用5%吐溫80配成一系列濃度的懸液，采取灌胃和腹腔注射兩種方式給藥。灌胃劑量為62.5、31.25及15.63mg/kg；腹腔注射劑量為31.25mg/kg。感染當天在感染后2h內灌胃或腹腔注射給藥1次，間隔4h再次給藥，每日2次，共5d。其余操作均同上。

1.4.3判斷指標及實驗分組

(1)死亡率及平均生活日

預防+治療實驗組每組10只小鼠，共6組［31.25mg/kg，15.63mg/kg，7.81mg/kg，RBV，病毒對照(5%的吐溫80)，正常對照］。每日觀察并記錄每組死亡只數，共2周，用χ2檢驗比較死亡率，用KaplanMeier法分析平均生活日。

治療實驗組每組10只小鼠，共7組［62.5mg/kg，31.25mg/kg，15.63mg/kg，31.25mg/kg(腹腔注射)，RBV，病毒對照(5%的吐溫80)，正常對照］。每日觀察并記錄每組死亡只數，共2周，同法統計死亡率和平均生活日。

(2)肺病變、肺指數

預防+治療實驗組每組8只小鼠，共6組［31.25mg/kg，15.63mg/kg，7.81mg/kg，RBV，病毒對照(5%的吐溫80)，正常對照］。感染后第4晚小鼠禁食，次日(即感染后5d)分組處死小鼠，取出鼠肺，肉眼判斷肺病變程度。0表示無肺病變，1～4為每級遞增25%的肺病變。每只小鼠稱體重(g)和肺重(g)，計算每只小鼠的肺指數(肺指數=肺重/鼠重)，用t檢驗分析法比較肺指數，用Ridit分析法比較肺病變。

治療實驗組每組8只小鼠，共7組［62.5mg/kg，31.25mg/kg，15.63mg/kg和31.25mg/kg(腹腔注射)，RBV，病毒對照(5%的吐溫80)，正常對照］。實驗操作、判斷指標的計算以及統計分析的方法同上。

(3)鼠肺TCID50滴定

預防+治療實驗組每組20只小鼠，3組［31.25mg/kg，RBV，病毒對照(5%的吐溫80)］。在感染后d1、d2和d4分別從每組中取5只小鼠解剖，無菌取肺，在低溫和無菌條件下分別按每個鼠肺加入10倍體積的細胞維持液，乳缽研磨，獲得勻漿，冷凍離心，轉速10000r/min。離心后取上清，得到鼠肺的10-1液，再以細胞維持液作10倍稀釋，分別獲得每個鼠肺的10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10液。在MDCK細胞中滴定上述鼠肺懸液的TCID50值，計算每組鼠肺每日平均TCID50值，作出曲線圖。

治療實驗組每組20只小鼠，4組［31.25mg/kg，31.25mg/kg(腹腔注射)，RBV，病毒對照(5%的吐溫80)］。實驗操作、判斷指標的計算以及統計分析的方法同上。

(4)LD50測定兩種給藥方案操作相同，均為每組5只小鼠，共5組(10-2，10-3，10-4，10-5，10-6)，每日觀察，記錄各組死亡只數，并用ReedMuench法計算半數致死濃度LD50。

2結果

2.1化合物1c的細胞毒性及體外抑制流感病毒實驗

化合物1c在MDCK細胞中抗流感病毒A型和流感病毒B型的活性以及對MDCK細胞的毒性結果見表1，陽性對照藥為扎那米韋。

表1數值顯示化合物1c對流感病毒A型、流感病毒B型不同株的

抑制活性差別較大，扎那米韋也顯示同樣情況；1c對流感病毒A型的抑制活性雖不及扎那米韋，但對流感病毒B型的抑制活性明顯高于扎那米韋。化合物1c以及扎那米韋對MDCK細胞的毒性測試結果為：化合物1c的CC50值大于318.05μmol/L，扎那米韋的CC50值大于1.50×104μmol/L。

2.2化合物1c體內抗流感病毒活性實驗

結果見表2。

(1)預防+治療給藥方案表2數據顯示，31.25mg/kg組的4項判斷指標與病毒對照組相比均有統計學意義；15.63和7.81mg/kg組與病毒對照組相比均顯示療效，在平均生活日指標上有統計意義的差別。

(2)治療給藥方案本次實驗除感染方案不同外，還增加了1c的劑量，觀察小鼠對1c的耐受情況，并增加一組1c的腹腔給藥，與灌胃給藥組在同等劑量下，觀察療效有無差別。表2結果顯示1c灌胃各劑量組各指標間呈量效關系，同為31.25mg/kg，腹腔注射組的療效優于灌胃給藥組，其療效相當于62.5mg/kg灌胃組，在肺病變及肺指數兩項指標上甚至優于62.5mg/kg灌胃組。小鼠對62.5mg/kg藥量耐受良好，在實驗期間，藥物毒性對照組體重增長情況與正常對照組相似，未見毒性反應(具體數據未列出)。

圖2列出治療給藥方案各組的肺病變照片；預防+治療給藥方案各組肺病變照片結果相似，未列出。

(3)治療給藥方案中鼠肺病毒分離情況圖3顯示治療給藥方案各組［31.25mg/kg，31.25mg/kg(腹腔注射)，RBV及病毒對照組］的鼠肺病毒分離及毒力圖2治療實驗中各組肺病變圖圖3小鼠肺內流感病毒滴度曲線測定(TCID50)結果。感染后d1，4組鼠肺TCID50相近，d2各組之間病毒TCID50分別為107.6/ml、107.1/ml、106.4/ml以及108.3/ml；d4病毒TCID50分別107.6/ml、106.9/ml、105.1/ml及107.2/ml。1c腹腔注射組病毒滴度降低比灌胃組更明顯，與其它指標相一致，RBV降低病毒滴度最明顯。

預防+治療方案各組(31.25mg/kg，RBV及病毒對照組)的鼠肺病毒分離及毒力測定TCID50結果與治療方案組相似，未列出。

3討論

對化合物1c進行的體內、外抗流感病毒活性研究結果顯示，1c具有廣譜抗流感病毒活性，且作用機制與金剛烷胺類抗病毒藥物不同。體外實驗中，1c對流感病毒A型各株的抑制活性雖不如扎那米韋，但1c對流感病毒B型的抑制活性明顯優于扎那米韋。在流感流行，病原診斷不明確時，1c有優勢。在感染了流感病毒甲1(H1N1)亞型(FM1株)的小鼠模型中，兩種給藥方案均顯示可重復的療效，并有量效關系。體內實驗結果表明1c腹腔注射途徑，藥物吸收較灌胃佳。由于1c可口服或注射給藥，而扎那米韋僅能局部噴藥，并需特殊給藥裝置，所以1c有一定的實用前景。原設計將oseltamivir作為陽性對照藥，比較1c與oseltamivir在動物實驗中的療效，但遺憾的是暫時無法獲得oseltamivir，我們正在積極尋求，以期解決上述表2化合物1c體內抗流感病毒甲1(H1N1)亞型小鼠感染作用治療方案及感染病毒量*：P<0.05；**：P<0.01。問題。

對1c抗流感病毒的作用機制研究，我們曾初步測定1c抗流感病毒A型粵防243/72株NA活性，發現1c對NA的IC50為42.0nmol/L，活性明顯低于扎那米韋0.26～0.72nmol/L。文獻報道扎那米韋對流感病毒A型不同株NA的IC50值分布范圍較廣，為0.3～5.99nmol/L［16，17］。有關1c的作用機制需要進一步研究。1c為我國自行研發的全新化合物，有專利保護。鑒于1c體內、外抗流感病毒的活性，有開發為抗流感病毒藥物的潛能。

致謝：感謝本研究室董飚碩士及章天主管技師對本工作的協助與支持。

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