針灸血清對(duì)乳腺癌MCF范文

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作者：李巖郭剛李彬史秀芳

【摘要】目的：觀察針灸對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。方法：針灸刺激雌性Wistar大鼠雙側(cè)足三里、三陰交、內(nèi)關(guān)穴，抽取大鼠“針灸血清”分別與MCF7細(xì)胞混合培養(yǎng)，分為電針組、艾灸組和對(duì)照組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，72h后流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及Fas表達(dá)率。結(jié)果：MCF7細(xì)胞Fas表達(dá)率明顯增高，72h達(dá)57.70%；MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，12h、24h、72h抑制率分別達(dá)17.55%、24.71%和31.85%；作用72h后的細(xì)胞凋亡率分別為1.07%、8.72%、10.18%,與艾灸組相近，均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論：“針灸血清”作用于MCF7細(xì)胞可能通過增加Fas的表達(dá)率來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】針刺・灸法・乳腺腫瘤・細(xì)胞凋亡・細(xì)胞周期

TheeffectofacupuncturalandmoxibustionaltherapyontheapoptosisofbreastcellMCF7

【ABSTRACT】Objective:ToobservetheeffectontheapoptosisofbreastcancercellMCF7withacupuncturalandmoxibustionaltherapy.Methods:ZusanliandSanyinjiaoneiguaninbothsidesoffemaleWistarmicewereacupuncturedandmoxibusted.MCF7cellwascultiratedwiththeserum.TodetectethecytoxicitywithMTT,anddetectetheapoptosicrateandFasexpressionratewithflowcytometryafter72hours.Results:TheFasexpressionwasobviouslyincreasedupto57.70%after72h.TheproliferationofMCF7wasinhibitedremarkably.Theinhibitionratewere17.55%,24.71%and31.85%after12h,24hand72h.Theapoptosicratewere8.72%and10.18%after72h,remarkablyhigherthanthecontrolgroup(P＜0.05).Conclusion:AcupuncturalandmoxibustionalserumcouldincreaseFasexpressionratetoinhibitproliferationofMCF7cellandinduceitsapoptosis.

【KEYWORDS】Acupuncture・Moxibustion・BreastNeoplasms・Apoptosis・Cellcycle

乳腺癌在我國(guó)的發(fā)病率不斷增高，尋找有效的治療方法具有深遠(yuǎn)的意義［1］。針灸在一定程度上能抑制腫瘤的生長(zhǎng)，對(duì)惡性腫瘤具有一定的治療作用，可緩解臨床癥狀，減輕放、化療后的副反應(yīng)，改善機(jī)體免疫功能，提高患者的生活質(zhì)量。針灸腧穴而采集的“針灸血清”是近年來針灸研究中提出的一種新的研究思路和方法。本文通過應(yīng)用針灸血清培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞mcf7，觀察針灸對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞周期的影響，為尋找針灸治療乳腺癌的途徑和方案以及為探討針灸抑瘤機(jī)制提供線索。

1材料與方法

1.1材料乳腺癌細(xì)胞株MCF7由山東中醫(yī)藥大學(xué)細(xì)胞室提供。雌性Wistar大鼠30只，體重250g左右，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。RPMI1640購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，新生小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所，二甲基亞砜分析純購(gòu)自北京亞太精細(xì)化工公司，MTT購(gòu)自SIGMA公司，F(xiàn)as、異硫氫酸熒光素（FITC）標(biāo)記的單克隆抗體IgG1及免疫陰性對(duì)照品IgG1FITC均為美國(guó)Pharmingen公司產(chǎn)品，由北京岳泰生物公司提供。FACScan型流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1針灸血清的制備［1］選用雌性健康Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、電針組和艾灸組各10只。電針組和艾灸組分別用電針和艾灸的治療方法在相當(dāng)于“足三里”、“三陰交”和“內(nèi)關(guān)”穴的部位進(jìn)行治療，電針組選用30號(hào)40mm毫針，直刺20~30mm，得氣后接MODELD68051型電針治療儀，選用連續(xù)波，留針20min。艾灸組用雀琢灸法灸穴位20min，連續(xù)6d，每天2次，在最后一次治療結(jié)束后1h，乙醚吸入麻醉，腹主動(dòng)脈取血，無菌分離血清，經(jīng)56℃、30min滅活處理后，置-20℃冰箱備用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)MCF7細(xì)胞株培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中，置37℃，5%CO2（體積比，下同）和飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2~3d胰酶消化傳代1次，當(dāng)細(xì)胞傳至第4代、細(xì)胞生長(zhǎng)良好、狀態(tài)穩(wěn)定時(shí)，用胰蛋白酶消化后，以2×105/cm2的密度重新種入30mm的6孔培養(yǎng)皿上，于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。第2天用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）將細(xì)胞清洗2次，分別加入正常鼠血清、電針鼠血清、電針鼠血清繼續(xù)培養(yǎng)72h。

1.2.3MTT法檢測(cè)MCF7細(xì)胞抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7細(xì)胞，胰酶分散計(jì)數(shù)，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，按每孔200μl接種于96孔板中（每孔細(xì)胞數(shù)為2×104個(gè)），置于37℃、5%CO2和飽和

濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24d，貼壁后倒掉RPMI1640培養(yǎng)液，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每一組設(shè)3個(gè)平行孔，分組如下：對(duì)照組（RPMI1640培養(yǎng)液中含10%正常鼠血清），電針組（RPMI1640培養(yǎng)液中含10%電針鼠血清），艾灸組（RPMI1640培養(yǎng)液中含10%艾灸鼠血清）。每一組分別加入血清200μl，再置培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12h、48h、72h后，每孔加入5mg/mlMTT20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入二甲基亞砜150μl，振蕩至結(jié)晶完全溶解，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定490nm波長(zhǎng)的吸光度（A值），計(jì)算抑制率，由抑制率說明針灸血清對(duì)人乳腺癌MCF7細(xì)胞株的敏感性。抑制率（%）=（對(duì)照組A值-含藥血清組A值）/對(duì)照組A值×100%。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化經(jīng)加入以上各組血清培養(yǎng)72h后的貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞數(shù)目分別約5×105，1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。經(jīng)PBS漂洗2次后，加入冰預(yù)冷的70%乙醇固定，4℃過夜。然后除去固定液，用3mlPBS溶液重懸細(xì)胞5min，1000r/min離心5min，棄去PBS溶液，加入PC緩沖液50μl，靜置20min，再加入100μg/mlPI液10μl，PBS溶液480μl，室溫避光30min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Modifit軟件（BD公司提供）分析數(shù)據(jù)。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)Fas表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化計(jì)數(shù)，37℃、5%CO2箱中培養(yǎng)24h，至細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛貼壁后，去掉培養(yǎng)液，分別加入以上各組血清培養(yǎng)液于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h。然后分別胰酶消化后離心，每支離心管中加入70%乙醇固定細(xì)胞，以PBS液漂洗2次后，再離心（1500r/m，5min）。取細(xì)胞懸液500μl，加入異硫氫酸熒光素標(biāo)記的鼠抗人的單克隆抗體IgG1工作液20μl，另各取一支陰性對(duì)照品IgG1FITC，室溫避光反應(yīng)30min后，由流式細(xì)胞儀熒光檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1針灸對(duì)細(xì)胞抑制率的影響見表1。由表1可見，針灸大鼠血清對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞的抑制率呈時(shí)間依賴性，電針組和艾灸組均能明顯抑制MCF7細(xì)胞增殖（P＜0.05），但電針組的抑制率高于艾灸組（P＜0.05）。表13組血清在不同時(shí)間段對(duì)MCF7細(xì)胞的抑制率（略）

2.2針灸對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化的影響見圖1~3，表2。各血清作用72h后，直方圖中均可見G0/G1期峰前的亞二倍體峰即凋亡峰，代表凋亡細(xì)胞群，以峰值高低代表凋亡細(xì)胞的比例。圖1、2、3顯示對(duì)照組、艾灸組和電針組的凋亡率分別為1.07%、8.72%、10.18%。由表2可以看出，各血清作用72h后，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)均明顯減少（P＜0.05），對(duì)照組、艾灸組和電針組的凋亡率分別為1.07%、8.72%、10.18(P＜0.05)。針刺和艾灸都能抑制MCF7細(xì)胞增殖，且兩者差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由表3可以看出，電針組和艾灸組大鼠血清對(duì)Fas的表達(dá)率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），但電針組與艾灸組對(duì)Fas表達(dá)率的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表23組MCF7細(xì)胞血清作用72h后細(xì)胞周期變化（略）表33組血清作用72h后MCF7細(xì)胞Fas表達(dá)

3討論

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的一種新的思路，而且治療腫瘤的有效性主要表現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和/或誘導(dǎo)凋亡［2，3］。本實(shí)驗(yàn)表明“針灸血清”能抑制乳腺癌MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)。“針灸血清”是近年來針灸研究中提出的一種新的研究方法，是指從針灸處理后的人或動(dòng)物體上采集到的血清，作為效應(yīng)物質(zhì)加入到另一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中，同在體或離體器官組織、細(xì)胞或分子靶目標(biāo)接觸，通過它們的功能或形態(tài)學(xué)的改變，直接地觀察針灸處理后的效應(yīng)［4，5］。“針灸血清”研究方法可歸納為離體實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)兩大類。本實(shí)驗(yàn)針灸大鼠血清離體作用于人的腫瘤細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，針灸刺激Wistar大鼠雙側(cè)足三里、三陰交、內(nèi)關(guān)穴后的大鼠“針灸血清”能使MCF7細(xì)胞抑制率升高，說明可以抑制體外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。與正常對(duì)照組比較，MCF7細(xì)胞S期和G2M期百分率均明顯降低，說明針灸血清能影響乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖，抑制其生長(zhǎng)。細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)化和治療過程中具有重要意義，許多抗腫瘤藥物是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用的。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，針灸刺激大鼠雙側(cè)足三里、三陰交、內(nèi)關(guān)穴，此大鼠“針灸血清”能誘導(dǎo)乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能是針灸腧穴后，通過某種內(nèi)在的生理調(diào)節(jié)機(jī)制，引起血清中Fas的表達(dá)率增高，從而誘導(dǎo)乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑制腫瘤的作用。針灸療法能促使經(jīng)絡(luò)暢通，氣血調(diào)和，改善機(jī)體免疫功能，可產(chǎn)生不同程度的類藥性作用。從這個(gè)角度講，似可把針灸穴位比喻為“藥物”，不具備藥的外在形態(tài)卻具有藥的某種作用實(shí)質(zhì)，這是針灸療法最本質(zhì)的特征之一。“針灸血清”可直接觀察其功能或?qū)嶒?yàn)物形態(tài)學(xué)的改變，有利于拓寬針灸研究的領(lǐng)域，推動(dòng)針灸作用及其機(jī)理研究，尋求一條治療惡性腫瘤的獨(dú)特道路。

參考文獻(xiàn)

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