細胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷范文
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一、心肌缺血再灌注過程中細胞凋亡的實驗依據
雖然目前有多項研究顯示缺血再灌注可誘發心肌細胞凋亡,但是關于凋亡是由心肌缺血性損傷所誘發還是由再灌注損傷所誘發的問題仍然存在有爭議。Kajstura等[2]發現,在體大鼠心肌缺血2~3h后即可出現凋亡細胞,缺血4.5h后凋亡細胞的數量達到高峰,然后逐漸降低。采用在體大鼠心肌缺血再灌注模型發現,持續缺血2.25h或缺血45min后再灌注1h均有凋亡細胞的產生,并且隨著再灌注時間的延長,凋亡細胞的數目增加[3]。與上述研究結果不同,采用在體家兔心肌缺血再灌注模型發現,單純缺血30min、4.5h和缺血5min再灌注4h的心肌細胞均未出現凋亡現象,而缺血30min再灌注4h的心肌細胞則出現了凋亡,因此認為凋亡是心肌對缺血再灌注損傷的一個特殊反應[4]。Zhao等[5]采用犬冠狀動脈完全性梗阻7h或梗阻1h后再灌注6h模型進行研究發現,盡管長時間缺血后可出現明顯的心肌壞死,但是原位TUNEL染色顯示壞死區的凋亡細胞極少,而且缺乏特征性“DNA梯狀條紋”。相比之下,缺血1h再灌注6h則可誘發凋亡細胞數目明顯增加和出現典型的特征性“DNA梯狀條紋”,而且凋亡細胞大多是出現在壞死心肌的周圍區域,即缺血后血管再通的相關部位和梗死灶的收縮帶區域。該研究結果提示,缺血再灌注后的心肌細胞凋亡主要是由再灌注過程誘發的。綜合上述文獻,目前認為長時間持續性缺血和再灌注均可誘發心肌細胞發生凋亡,尤其是再灌注后細胞內ATP水平迅速恢復、胞漿和線粒體內鈣超載以及自由基大量生成,更是加速了不可逆性細胞凋亡的發生[1]。
二、心肌缺血和再灌注過程中細胞凋亡及壞死的時程變化關系
在缺血后再灌注期間,心肌細胞的凋亡過程可分為幾個階段:①再灌注早期的起始階段;②中性粒細胞浸潤的中間階段;③數天、數周或數月之后的延遲階段,該階段可能與心室重塑和心功能衰竭的發生有關[6]。
對于心肌缺血和再灌注過程中細胞凋亡及壞死的演變規律,目前同樣存在著較大的爭議。Kajstura等[2]采用在體大鼠心肌缺血模型研究發現,心肌缺血2h后,凋亡細胞和壞死細胞同時出現;隨著缺血時間延長,在凋亡細胞增多的同時亦演變為壞死細胞。Zhao等[7]采用犬心肌局部缺血1h再灌注6h、24h、48h或72h模型研究發現,心肌壞死的程度在再灌注24h時最為嚴重,此后一直保持著相對恒定的狀態。相比之下,隨著再灌注時間延長,凋亡細胞在壞死組織周圍區進行性增多,至再灌注72h時達到高峰。這提示細胞壞死和細胞凋亡在再灌注期間可同時發生,并且在再灌注早期壞死的發生率相對較高,而在再灌注后期凋亡的發生率較高。
三、細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中的作用
由于再灌注期間凋亡細胞主要是出現在壞死心肌的周圍區域,所以提示凋亡可能在缺血再灌注后心肌梗死范圍的擴大中發揮著一定的作用[5]。為此,有人采用核酸內切酶抑制劑—金精三羧酸(ATA)分析了凋亡在缺血再灌注后心肌梗死中的作用[7]。結果顯示,在犬冠狀動脈梗阻1h再灌注24h模型上,再灌注開始時采用ATA處理可明顯減少壞死組織周圍區凋亡心肌細胞的數目,同時伴有特征性“DNA梯狀條紋”的缺失。這種凋亡程度的降低主要是與Bcl-2上調以及Bax和細胞凋亡蛋白酶(Caspase-3)活性降低有關。更為重要的是,ATA所致的心肌凋亡抑制可明顯縮小心肌梗死的面積。采用小鼠心臟特異性細胞凋亡蛋白酶過度表達模型的研究發現,在缺血后心肌細胞凋亡加重的同時,亦出現了心肌梗死面積的擴大和心功能的惡化[1]。這說明細胞凋亡和細胞壞死之間存在著一定的交叉和聯系,因此抑制心肌細胞凋亡可能是臨床上有效防治心肌缺血再灌注損傷的一條重要途徑。
四、心肌缺血再灌注過程中細胞凋亡的信號轉導通路
目前認為,各種促凋亡的損傷因素一般是通過激活死亡受體(deathreceptor,DR)依賴性信號轉導通路和線粒體依賴性信號轉導通路誘發細胞凋亡[8]。死亡受體被其相應的促凋亡配體激活后,可導致凋亡調控基因(主要是Bcl-2家族)表達失衡和胞漿蛋白酶(即Caspase家族)活化。而線粒體依賴性途徑被激活后,可誘發線粒體釋放細胞色素C(cytoC)和凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1),并與半胱天冬酶9的前體形成復合物,激活下游的半胱天冬酶。半胱天冬酶是細胞凋亡過程的執行器,通過上述兩條途徑激發半胱天冬酶家族的級聯反應是細胞發生凋亡的一個中心環節[9]。
(一)由死亡受體介導的細胞凋亡
腫瘤壞死因子(TNFα)、Fas配體(FasL)和TNF-相關性凋亡誘導配體(TRAIL)均可誘導細胞發生凋亡,因此被稱為死亡因子(deathfactor)。介導它們誘導凋亡作用的受體被稱之為死亡受體。位于細胞膜表面的死亡受體主要包括TNFR1(亦稱為p55或CD120a)、Fas(亦稱為CD95或Apo1)、DR3、DR4和DR5,它們的共同特征是胞內部分有一大約80個氨基酸殘基構成的死亡功能域(deathdomain,DD)。死亡因子可分別激活相應的受體,啟動導致凋亡的信號轉導通路。激活的死亡受體可與細胞內的多種亦具有死亡功能域的受體接頭蛋白相結合。其中,激活的Fas和DR3可與Fas相關性死亡功能域(FADD)相結合,而激活的TNFR1和DR4可與TNFR相關性死亡功能域(TRADD)相結合。此外,通過TRADD和FADD之間的相互作用,來自TNFR1的激活信號亦可與Fas信號轉導通路發生聯系[10]。
死亡受體激活后,可通過一系列反應激活胞漿內的胱門蛋白酶。一般認為,胱門蛋白酶的活化是凋亡執行過程中的最后通路。胱門蛋白酶家族屬于白介素-1β轉化酶(ICE)類蛋白,因可在天冬氨酸殘基之后將底物裂解,故目前被稱之為半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶。根據胱門蛋白酶在細胞凋亡中的作用及其N端的長度,可將其分為啟動子胱門蛋白酶(包括胱門蛋白酶-8、9和10)和效應子胱門蛋白酶(包括胱門蛋白酶-3、6和7,能被啟動子胱門蛋白酶所激活)。在正常情況下,胱門蛋白酶是以無活性的酶原形式存在。在心肌缺血性損傷和再灌注損傷的刺激下,Fas-FADD和TNFα-TRADD可誘導啟動子胱門蛋白酶-8和10的激活,然后酶解激活下游的效應子胱門蛋白酶-3、6和7而導致細胞凋亡。效應子胱門蛋白酶(尤其是胱門蛋白酶-3)是細胞凋亡的執行器,活化后可裂解破壞細胞的必需成分(例如細胞骨架和核蛋白)和抑制受損傷DNA的修復,從而誘發細胞凋亡。研究顯示,促凋亡配體與死亡受體結合后誘發細胞凋亡的反應可在數小時內迅速發生,無須RNA或蛋白質合成,而且亦不依賴于線粒體[11]。也有研究發現,死亡受體TNFR1被激活后還可進一步激活核轉錄因子κB(NF-κB)和絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)/c-jun氨基末端激酶(c-junN-terminalkinase,JNK)信號轉導通路來調控心肌細胞凋亡,但是激活后的信號轉導通路目前尚未被完全闡明[9]。
(二)由線粒體損傷啟動的細胞凋亡
在死亡信號到達線粒體之后,首先引起線粒體膜通透性轉運孔開放,然后線粒體內外膜間的凋亡誘導蛋白被釋放進入胞漿,主要包括cytoC、凋亡誘導因子(AIF)和半胱天冬酶-2、3、9的前體。在dATP的存在下,線粒體釋放的cytoC可與Apaf-1形成三聚體。該復合體可將半胱天冬酶-9的前體直接裂解為線粒體依賴性凋亡信號轉導通路中最上游的半胱天冬酶[11]。隨后,活化的半胱天冬酶-9可將半胱天冬酶-3的前體裂解為半胱天冬酶-3。而AIF可通過直接激活半胱天冬酶-3而誘發細胞凋亡。一般認為,凋亡的整個過程通常分為3個階段:①決定死亡階段:細胞表面的促凋亡信號與細胞內的抗凋亡信號發生聯合,促使細胞作出生與死的決策;②執行死亡階段:如果細胞內的平衡狀態傾向于凋亡,則可激活半胱天冬酶家族酶級聯反應或AIF核轉位而誘發DNA降解。③殘體清除階段:包括鄰近細胞對凋亡細胞的包圍和吞噬消化。由于細胞發展成為不可逆性凋亡的時間需數分鐘至數小時或更長,所以在凋亡過程執行前可通過操縱有關因素而影響結局。這就為損傷后治療干預提供了一個“機會窗”,在這個機會窗內采用一定的措施挽救走向凋亡的心肌細胞,可起到心肌保護作用[12]。
(三)線粒體與半胱天冬酶在誘導細胞凋亡中的相互關系
線粒體與半胱天冬酶在誘導細胞凋亡的過程中均具有重要作用,而且它們之間可互相獨立又可互相促進。總體來講包括下列三種情況:①C半胱天冬酶直接誘導細胞凋亡,沒有線粒體的參與,例如Fas誘導的凋亡;②線粒體直接誘導細胞凋亡,半胱天冬酶不參與。這種情況主要見于Bax或Bax類似蛋白大量表達而抑制半胱天冬酶,使DNA發生凝集(而半胱天冬酶可使DNA發生降解)和線粒體膜通透性轉運孔開放;③線粒體和半胱天冬酶共同參與細胞凋亡,以實現死亡信號的級聯放大,加快凋亡的發生[11]。
目前,線粒體損傷和半胱天冬酶活化在缺血再灌注過程中誘發心肌細胞凋亡的作用已經得到了證實。采用培養的心肌細胞缺氧/復氧模型、在體大鼠局部心肌缺血再灌注模型以及氧化應激介導的犬心室功能障礙模型進行的研究均發現,cytoC釋放以及半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-9活化可誘發心肌細胞凋亡。能夠阻斷cytoC釋放和半胱天冬酶活化的藥物和處理措施均可明顯減輕心肌細胞凋亡的程度,而加入外源性細胞色素C和dATP則可激活足以誘發心肌細胞凋亡的半胱天冬酶[6,11]。而且,在原發性心肌病患者心肌中檢測到的心肌凋亡細胞亦可能是由線粒體cytoC釋放所致的半胱天冬酶-3活化引起的。在犬心肌缺血再灌注損傷模型的研究顯示,缺血心肌內存在活化型半胱天冬酶-3的高度表達[7],并且抑制半胱天冬酶的活性可明顯減輕心肌細胞凋亡的程度和縮小心肌梗死的面積[13]。
五、心肌缺血再灌注過程中細胞凋亡的發生機制
(一)心肌細胞凋亡的基因調控
細胞凋亡的調控基因分為誘導基因(死亡基因)和抑制基因(生存基因)。在生理條件下,心肌細胞有序而協調地激活凋亡誘導基因(Bax、Fas、p53等)和/或凋亡抑制基因(Bcl-2等),共同調控細胞代謝而維持細胞內環境穩定。但是在缺血再灌注過程中,凋亡相關基因及其表達產物發生了變化,從而導致心肌細胞凋亡的發生。在調控凋亡的基因中,目前研究較多的是Bcl-2基因家族。
Bcl-2家族包括一組抗凋亡基因(Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Bag-1和BI-1)和一組促凋亡基因(Bax、Bak、Bad、Bid和Bim)。Bcl-2是最主要的抗凋亡基因,而Bax的作用則正好相反,Bcl-2/Bax的比值將決定細胞是否發生凋亡。研究發現,長時間缺血誘發心肌細胞發生凋亡之后,心肌內Bcl-2表達減少而Bax表達增多[14]。據報道,在梗死區周圍的存活心肌中有Bcl-2的陽性表達,而在心肌梗死區內則有Bax的過度表達。在Bcl-2過度表達的轉基因小鼠,缺血和再灌注所致的心肌細胞凋亡、心肌梗死和心功能均明顯減輕。
通常認為Bcl-2具有抗氧化自由基的作用,可通過減輕脂質過氧化和增強細胞對活性氧的耐受而預防凋亡的發生。另外,Bcl-2還可防止細胞內酸中毒、抑制細胞內鈣超載、抑制TNFα的合成和釋放、減輕促凋亡基因Bax的細胞毒性作用以及穩定線粒體膜電位和抑制線粒體釋放cytoC和AIF等。這些作用均有助于減輕缺血再灌注過程中心肌細胞凋亡的發生[14]。
(二)心肌細胞凋亡的外部誘發因素
1.中性粒細胞浸潤研究發現,中性粒細胞在再灌注心肌中聚集增加可加重心肌細胞凋亡的程度,并且危險區中性粒細胞聚集與凋亡細胞數目的增加呈線性關系,提示中性粒細胞與心肌細胞凋亡的發生密切相關[5,15]。關于中性粒細胞如何介導心肌細胞凋亡的發生目前尚不十分清楚,可能是由于中性粒細胞聚集堵塞微血管而導致無復流現象,亦可能與中性粒細胞活化后釋放大量的炎性介質(例如自由基和細胞因子)有關[16]。
2.巨噬細胞活化采用離體和在體心肌缺血再灌注損傷模型的多項研究顯示,巨噬細胞誘發的炎癥反應可能是促發心肌細胞凋亡的重要因素[16,17]。離體實驗研究顯示,巨噬細胞可通過釋放細胞因子和細胞毒性介質(例如TNFα和NO)而誘發細胞凋亡。在大鼠離體心肌細胞進行的研究發現,巨噬細胞釋放的細胞因子可呈時間依賴性誘導心肌細胞凋亡。近年來也還有研究發現,缺血再灌注心肌內的大部分巨噬細胞在再灌注6~24h內一直維持著較為完整的形態,直到48h后才發生明顯的脫顆粒。再灌注48h和72h后聚積在危險區內的巨噬細胞數和凋亡細胞數呈明顯的線性關系,提示活化的巨噬細胞可能參與了再灌注誘發的延遲性心肌細胞凋亡[5,17]。
3.非炎癥細胞激活在心肌缺血再灌注過程中,除了上述炎癥細胞之外,被激活的血管內皮細胞和心肌細胞亦可合成和釋放大量的炎癥介質,然后通過死亡受體依賴性信號轉導通路而誘發心肌細胞凋亡[15]。
4.氧化應激增強多項研究顯示,氧自由基是啟動凋亡的重要因子,采用抗氧化劑和自由基清除劑可有效抑制細胞凋亡的發生。氧自由基誘發凋亡的機制可能為:①氧化破壞內質網和線粒體膜的完整性而導致細胞內鈣超載;②促使線粒體膜通透性轉運孔開放而釋放cytoC;③激活轉錄因子AP-1和NF-κB,后者可通過上調TNFα和白介素-6而誘導心肌細胞凋亡的發生[18]。
5.細胞因子與黏附分子大量表達在心肌缺血再灌注期間,活化的巨嗜細胞、肥大細胞、中性粒細胞以及心肌細胞本身可產生大量的細胞因子和黏附分子。細胞因子不僅可促進心肌炎癥,而且還可與黏附分子相互作用而加重心肌細胞凋亡[15]。在缺血和再灌注期間,心肌細胞內的TNFα表達明顯上調,TNFα可通過下列機制誘發心肌細胞凋亡:①與其受體TNFR1結合后,直接激活心肌細胞凋亡的信號轉導通路;②激活酸性鞘磷脂酶,通過產生脂質信使神經酰胺而介導細胞凋亡的發生;③誘導內皮細胞和部分心肌細胞表達IL-1、IL-2、IL-6、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血小板活化因子,促進中性粒細胞與內皮細胞的黏附和脫顆粒,并激活NADPH氧化酶而釋放氧自由基,從而間接地調控凋亡過程[19]。
6.細胞內鈣超載細胞內鈣超載是各種損傷因素的最后共同通路。在缺氧誘導的心肌細胞凋亡中,無論是阻斷細胞外Ca2+內流還是減少細胞內Ca2+釋放,均能有效減少心肌細胞凋亡的發生[20]。細胞內Ca2+濃度升高后可激活內源性Ca2+-Mg2+依賴性核酸內切酶,使細胞核內染色體DNA降解成寡核苷酸片段。此外,Ca2+還可激活Ⅱ型轉谷酰胺酶,使大量蛋白質發生交聯,在脂質膜下形成蛋白質網,防止胞漿內成分外漏,避免了像壞死所致的炎癥反應。而且,轉谷酰胺酶還參與了胞漿膜的修飾,從而有利于吞噬細胞識別形成的凋亡小體而將其吞噬。
7.細胞內酸中毒在心肌缺血再灌注時,無氧代謝可導致細胞內、外H+濃度增加而引起酸中毒。細胞內酸化可使細胞趨向凋亡,可能與凋亡過程中的一些酶例如核酸內切酶的最佳pH<7.0有關[15]。
8.一氧化氮與細胞凋亡一氧化氮(nitricoxide,NO)是體內一種重要的生物信號分子,在心血管生理學和病理學過程中發揮著重要調節作用。研究發現,NO具有細胞毒性作用,可增強氧化應激(尤其是iNOS的激活和過氧亞硝基陰離子的大量生成)、干擾能量代謝、直接損害DNA、激活多聚ADP核糖聚合酶[PARP]或擾亂細胞內Ca2+穩態,從而誘導包括心肌細胞在內的多種細胞發生凋亡;但是亦有研究報道,NO是一種細胞保護因子,可通過抑制中性粒細胞的黏附和聚集、上調cGMP、抑制Bcl-2降解和線粒體釋放cytoC以及降低半胱天冬酶的活性而抑制細胞凋亡的發生[21,22]。至于NO在心肌缺血再灌注過程中是發揮促進細胞凋亡還是抑制細胞凋亡的作用,可能取決于NO在心臟內發揮作用的濃度和心臟的氧化還原狀態。
六、缺血再灌注過程中心肌細胞凋亡的防治
目前,防治心肌缺血再灌注過程中細胞凋亡發生的措施包括:消除誘發細胞凋亡的因素、切斷細胞凋亡信號轉導途徑、提高心肌細胞內源性保護機制和瓦解細胞凋亡信號。由于心肌缺血再灌注過程中細胞凋亡的發生是多因素和多途徑的,所以阻斷細胞凋亡級聯反應中的關鍵環節和抑制參與多信號途徑的介質是防治細胞凋亡的最有效方法[15]。
研究發現,β受體阻斷劑可抑制高濃度兒茶酚胺促發的細胞凋亡[23],血管緊張素轉換酶抑制劑亦可抑制血管緊張素Ⅱ引起的心肌細胞凋亡。針對氧化應激[18]、細胞內鈣超載[24]和改善心肌血流灌注[15]的方法亦具有同樣的效應。采用可溶性死亡受體或受體拮抗劑清除死亡因子,可減輕死亡受體介導的心肌細胞凋亡[1]。
采用抗凋亡基因Bcl-2產物和可溶性存活因子例如胰島素樣生長因子1(IGF1)能夠抑制缺血所致的細胞凋亡[25]。IGF1過度表達可減少非梗死區細胞凋亡和促進梗死后有利的心肌重構。細胞凋亡的執行包括線粒體擴大和半胱天冬酶激活在內的一系列信號途徑的活化。內源性半胱天冬酶抑制劑能抑制缺血再灌注刺激所致的細胞凋亡。抑制半胱天冬酶的藥物亦可短期抑制心肌細胞凋亡的發生。研究發現,L-肉堿可抑制半胱天冬酶和降低TNFα,從而防止心肌細胞凋亡的發生[19]。
許多研究報道,缺血預處理具有抑制缺血再灌注心肌細胞凋亡的作用。缺血預處理抑制細胞凋亡的機制與激活PKC和減輕缺血期細胞內酸化有關。此外,缺血預處理還可通過減輕炎癥細胞與內皮細胞的相互作用、抑制Bax在缺血區的表達、減少線粒體cytoC釋放和抑制半胱天冬酶的活性而減少細胞凋亡的發生[21]。
總之,再灌注期間心肌細胞凋亡的過程是可以干預的,提示我們可從細胞凋亡的角度進行缺血再灌注心肌保護的研究。通過消除細胞凋亡的誘發因素、抑制細胞凋亡的信息傳導通路和基因治療,同時開發抗細胞凋亡的藥物及相關基因生物制品,有望可更好地防治心肌缺血再灌注損傷。
