基因甲基化與喉鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系范文

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《醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)》2014年第六期

1資料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)方法

1．1．1主要試劑及儀器蛋白酶K(北京艾比根生物技術(shù)有限公司);Tris．Base(上海拜沃生物科技有限公司);WizardDNAClean-UpSystem(Promega公司);Tap酶(Invitrogen，USA);甲基化轉(zhuǎn)移酶(M．SssI)(NEB公司，美國);引物、三氯甲烷、飽和酚、乙二胺四乙酸、十二烷基磺酸鈉、無水乙醇(大連寶生生物公司)。恒溫水浴箱(SHELLAB公司，美國);高速離心機(jī)(Eppendorf公司);GeneAmp9700型PCR擴(kuò)增儀(ABI公司，美國);凝膠自動成像儀(TOCAN320型);電泳儀(伯樂公司，美國)。

1．1．2DNA提取采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶K消化法進(jìn)行DNA提取，在提取之前，組織標(biāo)本經(jīng)HE染色證實(shí)腫瘤細(xì)胞的存在，并選擇惡性腫瘤細(xì)胞≥75%的區(qū)域的組織提取DNA。

1．1．3亞硫酸氫鈉修飾參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行操作［6］:先將約2μgDNA在1．5mLEP管中，用雙蒸水稀釋至50μL，加5．5μL新鮮配制的3molNaOH后42℃水浴30min，然后加30μL10mmol/L對苯二酚至上述水浴后的混合液中;再加入520μL3．6mol亞硫酸氫鈉(配制:1．88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋，并以3mol/LNaOH滴定溶液至PH5．0，最終體積為5mL)。EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液，加200μL石蠟油，50℃避光水浴16h。

1．1．4修飾后的DNA純化回收預(yù)熱樹脂10min(37℃)，將移液器槍頭伸入石蠟油層下吸取混合液600μL至一潔凈2mLEP管中;然后使用PromegawizardCleanupDNA純化回收系統(tǒng)，對修飾后的DNA進(jìn)行純化回收。

1．1．5甲基化特異性PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系:去離子水11．65μL;10×buffer2μL;dNTP1．6μL;上、下游引物各1μL;DNA模板3μL;Tap酶0．15μL;加去離子水至20μL。循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性5min后35個(gè)循環(huán):94℃變性30s，54℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，最后1個(gè)循環(huán)延伸5min。將產(chǎn)物瓊脂糖凝膠(2．5g/L)電泳，GeneFinder染料染色。以甲基化酶處理正常人外周血細(xì)胞、去離子水分別作為甲基化陽性對照、甲基化陰性對照及空白對照。每批標(biāo)本同時(shí)擴(kuò)增甲基化和非甲基化陽性對照。甲基化上游引物:5''''-GTTAGTTTTTTTTTTTATTT-TAGTGGTTCGA-3''''，下游引物:5''''-TCCAAAACCTC-CCGAAAACGAAAACG-3'''';非甲基化上游引物:5''''-GGT-TAGTTTTTTTTTTTATTTTAGTGGTTTGA-3''''，下游引物:5''''-ATTTCCAAAACCTCCCAAAAACAAAAACA-3''''。

1．2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS20．0軟件進(jìn)行處理，RECK基因啟動子區(qū)甲基化狀況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，必要時(shí)采用Fisher確切概率法。對完成至少5年隨訪的患者行生存分析。生存曲線采用Kaplan-Meier法估計(jì)，并采用Log-rank檢驗(yàn)分析不同組別的差異。危險(xiǎn)因素與患者總體生存率的關(guān)系采用多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析，以P≤0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1臨床及病理學(xué)特征70例患者中，共有37例(52．86%)發(fā)生RECK基因甲基化，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，RECK基因甲基化在不同年齡、性別，吸煙、飲酒、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否，TNM分期間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);腫瘤組織中等及高分化的患者的RECK基因甲基化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于分化程度較低的患者。15名正常人喉黏膜組織均未發(fā)現(xiàn)甲基化。見表1。

2．2喉鱗狀細(xì)胞癌及正常組織的甲基化情況37例(52．86%)原發(fā)喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本發(fā)生甲基化，見圖1。29對喉鱗狀細(xì)胞癌-癌旁組織匹配的標(biāo)本中，喉鱗狀細(xì)胞癌組織發(fā)生RECK基因甲基化16例(55．12%)，癌旁組織發(fā)生RECK基因甲基化8例(27．59%)，經(jīng)配對四格表資料的精確概率檢驗(yàn)，2組的甲基化率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．029)。見表2。

2．3RECK基因啟動子區(qū)甲基化與患者的生存預(yù)后的關(guān)系本組70例患者中，64例完成了5年隨訪，中位無瘤生存期為41個(gè)月，中位總體生存期為52個(gè)月。本研究只針對完成5年隨訪的64例患者分析RECK基因啟動子區(qū)甲基化與生存預(yù)后的關(guān)系。經(jīng)Log-rank分析，RECK基因甲基化可明顯縮短患者的無瘤生存期和總體生存期(P=0．017，P=0．024)，見圖2。此外，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ-Ⅳ級臨床分期、腫瘤組織中等及高分化與患者較差的預(yù)后有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ-Ⅳ級臨床分期可明顯縮短患者的無瘤生存期和總體生存期。腫瘤組織中等及高分化可縮短患者的無瘤生存期。見表3。行多因素COX回歸(ENTER)分析，無瘤生存期及總體生存期的COX回歸方程擬合效果均較好(χ2=12．374，P＜0．001;χ2=24．123，P=0．001)，結(jié)果顯示:RECK基因甲基化是患者無瘤生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;總體生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素為:有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、RECK基因甲基化，提示:RECK基因甲基化與喉鱗狀細(xì)胞癌患者的生存期具有重要的關(guān)系。見表3、表4。

3討論

RECK基因啟動子區(qū)的甲基化與許多惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤有關(guān)。本研究結(jié)果顯示:RECK基因甲基化不僅在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中發(fā)生，而且在喉鱗狀細(xì)胞癌旁正常組織中也會發(fā)生，并且在15名健康者正常組織中均未見RECK基因甲基化，說明抑癌基因甲基化可作為惡性腫瘤早期發(fā)生的生物學(xué)標(biāo)志。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)29對喉鱗狀細(xì)胞癌組織-癌旁組織匹配的標(biāo)本中，有3例僅在癌旁組織中發(fā)生了甲基化，而相對應(yīng)的喉鱗狀細(xì)胞癌組織中未發(fā)現(xiàn)RECK甲基化，提示病理學(xué)正常的組織發(fā)生RECK基因甲基化可能預(yù)示著惡性腫瘤附近的組織具有一個(gè)范圍較大的潛在的甲基化區(qū)域，在肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律，因此，抑癌基因啟動子區(qū)甲基化可看做是惡性腫瘤的一類癌前病變［7］。RECK基因一種新型抑癌基因，定位于9P13-9P12，通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetallopepti-dase，MMP)而實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞再生、浸潤和轉(zhuǎn)移的作用［8－9］。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在惡性腫瘤組織中，MMP2、MMP9均呈高表達(dá)，特別是MMP2的陽性表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)狀態(tài)等病理特征具有重要關(guān)系［10－11］。有研究提示，RECK基因高表達(dá)的腫瘤患者的生存預(yù)后明顯優(yōu)于RECK基因低表達(dá)者［12］。

這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合提示:喉鱗狀細(xì)胞癌RECK基因由于甲基化而滅活，從而使患者的生存預(yù)后更差［11，13］。因此，去甲基化可應(yīng)用于抗腫瘤的治療過程中，可為改善包括喉鱗狀細(xì)胞癌在內(nèi)的惡性腫瘤患者的治療帶來新希望［15］。以往有研究表明:吸煙、飲酒是影響惡性腫瘤患者生存的危險(xiǎn)因素，這一規(guī)律也得到了很多學(xué)者的認(rèn)同［16］。但本研究發(fā)現(xiàn)吸煙、飲酒與患者的生存率關(guān)聯(lián)不大，但這并不意味著吸煙、飲酒不是喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存率的影響因素。喉癌的早期癥狀為聲音嘶啞、有異物感、痰多、咽部不適等，這些癥狀的存在，可能會使患者減少吸煙、飲酒，從而減弱了其與喉鱗狀細(xì)胞癌的真實(shí)關(guān)聯(lián)。因此，吸煙、飲酒仍然是影響喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存的潛在危險(xiǎn)因素，并具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本研究重點(diǎn)分析了RECK基因啟動子甲基化狀況與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果表明:甲基化的RECK基因檢測是預(yù)測患者較差預(yù)后的新途徑，越來越多的研究結(jié)果支持這一觀點(diǎn)［12－13］。RECK基因啟動子區(qū)甲基化是人喉鱗狀細(xì)胞癌的早期事件，在癌旁正常組織中也可發(fā)生，并且與患者較差的預(yù)后有重要關(guān)聯(lián)。RECK基因啟動子區(qū)甲基化可作為一個(gè)重要的早期發(fā)現(xiàn)并預(yù)測患者預(yù)后的早期生物標(biāo)志物。

作者：崔靜李輝田艷勛單位：邢臺市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科