人結(jié)腸癌細(xì)胞惡性表型的影響范文

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《醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)》2014年第六期

1材料與方法

1．1細(xì)胞轉(zhuǎn)染體系建立及實(shí)驗(yàn)分組HT-29和HCT-116細(xì)胞株轉(zhuǎn)染方法按Lipofectamine2000產(chǎn)品說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前1d將細(xì)胞分別以1×105個(gè)/孔、5×104個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，使轉(zhuǎn)染前細(xì)胞融合率達(dá)到60%～70%。轉(zhuǎn)染時(shí)設(shè)定脂質(zhì)體的濃度分別為0．5、1、1．5μL，并將其稀釋于RPMI1640或DMEM培養(yǎng)基50μL，pGPH-shFoxM1及其陰性對照pGPH-shNC的濃度分別為:0．5、1、2、4μg，稀釋后脂質(zhì)體靜置5min，與同樣用培養(yǎng)基50μL稀釋的質(zhì)粒混合，靜置20min，分別加入24孔板中。轉(zhuǎn)染6h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48～72h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。HCT-116、HT-292種細(xì)胞株均分為3組，具體如下述:①空白對照組(不轉(zhuǎn)染組);②實(shí)驗(yàn)對照組:轉(zhuǎn)染相應(yīng)空載質(zhì)粒(pGPH-shNC及pEX-2-NC);③實(shí)驗(yàn)組:轉(zhuǎn)染FoxM1干擾質(zhì)粒及FoxM1過表達(dá)質(zhì)粒。

1．2熒光實(shí)時(shí)定量(realtimePCR，RT-PCR)法檢測FoxM1基因表達(dá)水平取各組轉(zhuǎn)染后24h細(xì)胞，采用Trizol提取總RNA，經(jīng)Dnase酶消化基因組DNA后，采用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime-Script1stStrandcDNASynthesisKit)進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄，方法參照試劑盒說明書。同時(shí)采用TAKARA公司的定量試劑盒(SYBRPremixExTaq)進(jìn)行RT-PCR檢測，反應(yīng)體系參考試劑盒說明書。PCR反應(yīng)條件為95℃，10s;60℃，10s;72℃，10s;共40個(gè)循環(huán)。讀取CT值，采用△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。FoxM1的定量引物為:正義鏈:5''''-AACCGCTACT-TGACATTGG-3''''，反義鏈:5''''-GCAGTGGCTTCATCTTCC-3''''。GAPDH的定量引物為:正義鏈:5''''-TGTTGCCAT-CAATGACCCCTT-3''''，反義鏈:5''''-CTCCACGACGTACT-CAGCG-3''''。

1．3Westernblot方法檢測FoxM1蛋白表達(dá)水平提取轉(zhuǎn)染72h后各組細(xì)胞的總蛋白，并進(jìn)行蛋白定量，按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［11］所述方法配制SDS-PAGE分離膠(12%)和濃縮膠(5%)，待膠凝固后每孔上樣30μg蛋白，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、顯像。利用圖像分析儀對膠片顯像條帶進(jìn)行灰度分析，以內(nèi)參照β-actin進(jìn)行校正。

1．4劃痕愈合試驗(yàn)取對數(shù)生長期穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞接種于包被CollagenⅣ的6孔板，置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜后回收CollagenⅣ，再將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中干燥過夜，培養(yǎng)至細(xì)胞呈現(xiàn)出單層貼壁生長狀態(tài)。分別在各組單細(xì)胞層上劃痕，用含10%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以使劃痕愈合。分別于劃痕后0、12、24、48h每個(gè)孔取4個(gè)視野拍照，在倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合能力，用愈合率代表愈合能力。

1．5Transwell侵襲試驗(yàn)取對數(shù)生長期穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用無血清RPMll640培養(yǎng)過夜。通過24孔趨化小室和matrigel膠檢測細(xì)胞侵襲性。結(jié)果表示為穿過matrigel膠和聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)，顯微鏡下每個(gè)復(fù)孔取5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)(×400)，計(jì)算平均值。

1．6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間均值比較采用t檢驗(yàn)，多組之間均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)。以P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．12株人腸癌細(xì)胞系的FoxM1表達(dá)分析RT-PCR及Westernblot檢測均顯示，F(xiàn)oxM1在HT-29細(xì)胞中表達(dá)水平較HCT-116高。見圖1。

2．2HT-29和HCT-116轉(zhuǎn)染體系的建立采用pGPH-shNC(FAM)空載體轉(zhuǎn)染HT-29和HCT-116細(xì)胞48h后檢測熒光信號，根據(jù)熒光強(qiáng)度檢測轉(zhuǎn)染效率，從而建立高效的HT-29和HCT-116轉(zhuǎn)染體系。結(jié)果表明，脂質(zhì)體為1μL/孔，pGPH-shNC(FAM)濃度2μg/孔時(shí)，共培養(yǎng)48h為最佳的轉(zhuǎn)染條件。見圖2。

2．3FoxM1基因?qū)T-29和HCT-116侵襲性的影響為研究FoxM1的表達(dá)對人結(jié)腸癌細(xì)胞的調(diào)控，本研究基于優(yōu)化的HT-29和HCT-116轉(zhuǎn)染體系，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)有效下調(diào)FoxM1在HT-29細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)采用過表達(dá)質(zhì)粒調(diào)高HCT-116中FoxM1表達(dá)水平，24h后提取RNA，72h后提取蛋白。RT-PCR檢測結(jié)果表明HCT-116細(xì)胞株中過表達(dá)FoxM1后其mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)，采用pGPH-shFoxM1轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞后，F(xiàn)oxM1表達(dá)水平顯著下調(diào)。Westernblot結(jié)果亦表明，F(xiàn)oxM1蛋白在HT-29中成功下調(diào)，在HCT-116中成功上調(diào)。見圖3。

2．3．1劃痕愈合實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染pGPH-shFoxM148h后，HT-29的增殖能力明顯受到抑制，愈合率僅為(10．37±3．86)%，與HT-29實(shí)驗(yàn)對照組(42．0±2．0)%及HT-29空白對照組(37．0±2．2)%相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。而在HCT-116細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)FOXM1后，愈合率提高至(70．92±1．48)%，表示增殖力明顯得到了提高，與HCT-116實(shí)驗(yàn)對照組［(18．43±3．01)%］及HCT-116空白對照組［(67．36±2．61)%］相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。見圖4。

2．3．2Tanswell小室檢測細(xì)胞侵襲能力HT-29和HCT-116腸癌細(xì)胞接種在Matrigel膠鋪被的transwell小室中48h之后，HCT-116實(shí)驗(yàn)組平均穿膜細(xì)胞數(shù)［(186．0±6．8)個(gè)］較HCT-116實(shí)驗(yàn)對照組［(42．0±2．0)個(gè)］和HCT-116空白對照組［(37．0±2．2)個(gè)］升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);HT-29實(shí)驗(yàn)組平均穿膜細(xì)胞數(shù)［(53．0±1．8)個(gè)］較HT-29空白對照組［(118．0±4．0)個(gè)］和HT-29實(shí)驗(yàn)對照組［(95．0±2．2)個(gè)］降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。見圖5。

3討論

FoxM1參與細(xì)胞增殖、凋亡以及人體多種器官發(fā)育［4］。FoxM1僅表達(dá)于高增殖狀態(tài)的細(xì)胞中，如所有胚胎組織，特別是上皮和間質(zhì)的增殖細(xì)胞中;在人體組織中，F(xiàn)oxM1僅高度表達(dá)于胸腺和睪丸組織，中度表達(dá)于肺和腸道［12］。惡性腫瘤的發(fā)生正是由于在致癌因素作用下，遺傳物質(zhì)發(fā)生改變導(dǎo)致細(xì)胞增殖信號過度活化。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1常高表達(dá)于肝癌［13］、前列腺癌、胃癌［15］等多種惡性腫瘤中，同時(shí)，它與多種癌基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)［16］，包括表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)信號通路、磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide3kinese/proteinkinaseB，PI3K/Akt)信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)信號通路、細(xì)胞外信號激酶(extracellularsig-nal-regulatedkinase，ERK)信號通路、蛋白酶體通路等。特異性FoxM1抑制劑在腫瘤治療方面的研究提示FoxM1極有希望成為一個(gè)新的抗癌靶點(diǎn)。在肝細(xì)胞癌(hepaticcellulercancer，HCC)中，F(xiàn)oxM1是ERK的主要效應(yīng)器。FoxM1b在HCC小鼠模型及HCC細(xì)胞系中，均有高表達(dá)。其表達(dá)增高與ERK正相關(guān)，可促進(jìn)HCC的腫瘤血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。相反，抑制FoxM1b表達(dá)，可下調(diào)ERK激活水平，減少HCC細(xì)胞株的血管形成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。FoxM1c可增強(qiáng)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子cyclinE/Cdk2的表達(dá)，后者被認(rèn)為是c-myc基因的反式激活啟動子［4］。有學(xué)者在胃癌細(xì)胞株研究中發(fā)現(xiàn)，c-myc是FoxM1調(diào)控的下游基因。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1和NF-κB在細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、細(xì)胞遷移等生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，但兩者之間的相互作用機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。Ma等發(fā)現(xiàn)，Raf/MEK/MAPK的激活對于FoxM1核轉(zhuǎn)移不可或缺，同時(shí)，可促進(jìn)FoxM1與cyclinB1之間交互作用，繼而促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂。應(yīng)用Raf/MEK/MAPK抑制劑U0126后，F(xiàn)oxM1表達(dá)顯著受抑，并使細(xì)胞停滯于G2/M期。綜上所述，F(xiàn)oxM1表達(dá)失調(diào)與多種細(xì)胞增殖、凋亡等進(jìn)程相關(guān)細(xì)胞因子及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均相關(guān)，已成為研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的新熱點(diǎn)分子。

本研究在細(xì)胞水平探索了FoxM1表達(dá)水平變化對結(jié)腸癌細(xì)胞的體外運(yùn)動和侵襲性。首先針對FoxM1基因設(shè)計(jì)了3條不同的siRNA干涉序列，優(yōu)化siRNA轉(zhuǎn)染條件后應(yīng)用不同的siRNA對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，最終選定抑制效果最強(qiáng)的FoxM1siRNA。繼而根據(jù)該序列合成干擾表達(dá)質(zhì)粒pGPH-shFoxM1。應(yīng)用RT-PCR及Westernblot檢測，提示FoxM1在HT-29細(xì)胞中高表達(dá)，而在HCT-116細(xì)胞中呈低表達(dá)。進(jìn)一步在細(xì)胞水平探索了FoxM1表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞的體外運(yùn)動和侵襲性的影響。采用RNA干擾的方法下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中FoxM1表達(dá)水平并采用過表達(dá)質(zhì)粒調(diào)高HCT-116中FoxM1表達(dá)，利用劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)探討FoxM1對結(jié)腸癌細(xì)胞生長和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示RNA干擾可使FoxM1表達(dá)下調(diào)，下調(diào)FoxM1表達(dá)可抑制細(xì)胞的遷移能力和侵襲性。反之，過表達(dá)質(zhì)粒可有效調(diào)高FoxM1表達(dá)水平，上調(diào)FoxM1表達(dá)可提高細(xì)胞的遷移能力和侵襲性。本研究與Kalinichenko等研究結(jié)果相似，抑制FoxM1表達(dá)可顯著抑制肝癌等多種細(xì)胞的遷移能力和增殖性。這些結(jié)果均為尋找新的治療靶點(diǎn)提供了有力的依據(jù)。總之，F(xiàn)oxM1對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力具有重要的影響，具有發(fā)展成新型結(jié)腸癌治療靶位的潛力。

作者：冒曉蓓劉小北徐凱褚曉源郁紅菊薛利軍陳亞楠任麗麗戴婷婷陳龍邦單位：第二軍醫(yī)大學(xué)南京臨床醫(yī)學(xué)院