轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白基因的克隆范文

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《生物技術(shù)通報雜志》2014年第七期

1材料與方法

1.1材料

嗜水氣單胞菌Zf1菌株由本實驗室保藏。細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，pMD18-TVector購自TaKaRa公司，UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、PCR擴增試劑均購自上海捷瑞生物工程公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計與合成參考嗜水氣單胞菌AhyR基因序列（登錄號：YP_855090），設(shè)計特異性上下游引物（AhyR-F：CGATTGCGAAAGCGATAA；AhyR-R：CTGCTGAGCCATTGGTTTT）用于PCR擴增Zf1菌株AhyR基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2Zf1菌株AhyR基因克隆參考李雪等［10］方法，將Zf1菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)12h。取1mL菌液用于提取基因組DNA，具體操作參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書。將提取到的基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆谩CR擴增采用10μL體系：提取的Zf1菌株基因組DNA模板1.0μL，上下游引物各0.5μL，MasterMix5.0μL，ddH2O3μL。PCR循環(huán)條件為：94℃預變性2min，94℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸2min，經(jīng)30個循環(huán)后72℃再延伸10min。得到目的條帶后，按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說明書回收目的基因。將膠回收得到的DN段用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆?。將AhyR基因膠回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，陽性克隆菌樣送上海生工測序。

1.2.3基因序列及其結(jié)構(gòu)分析用Editseq推測氨基酸序列，利用MotifScan、blastp程序預測結(jié)構(gòu)域，NetPhos2.0Server預測磷酸化位點。通過鄰接法（Neighbor-Joining），應(yīng)用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析。將蛋白氨基酸序列提交SWISS-MODEL預測三級結(jié)構(gòu)，用RasMolVersion2.7.5.2查看蛋白三級結(jié)構(gòu)，并用拉馬錢德蘭圖（Ramachandranplot）檢測蛋白模型的合理性。

2結(jié)果

2.1Zf1菌株AhyR基因克隆及序列分析PCR擴增得到一條特異性條帶（圖1），測序獲得AhyR基因大小為1063bp，引物序列見圖2，推測ORF編碼260aa；查找結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)AhyR蛋白18-168aa區(qū)域為自體誘導物結(jié)合域（PF03472），176-241aa區(qū)域為LuxR型螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（PS50043），183-227aa區(qū)域為DNA結(jié)合域（PF04967）（圖3）；預測AhyR蛋白含有13個磷酸化位點，其中有8個絲氨酸（15S、62S、144S、145S、156S、173S、200S、227S）、3個蘇氨酸（30T、184T、188T、）和2個酪氨酸（161Y、231Y），進一步預測酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（15S、173S、184T、199T）和蛋白激酶C磷酸化位點（173S、184T、210T、222T）（圖4）。

2.2AhyR基因蛋白序列比對及系統(tǒng)進化樹分析對AhyR蛋白進行多重序列比對表明氣單胞屬不同菌種AhyR氨基酸序列高度保守，與殺鮭氣單胞菌（A.salmonicida）、維隆氣單胞菌（A.veronii）、豚鼠氣單胞菌（A.caviae）、中間氣單胞菌（A.media）、簡達氣單胞菌（A.jandaei）序列同源性分別為100%、99.62%、99.23%、98.85%、94.23%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析顯示AhyR為LuxR同源蛋白之一，AhyR蛋白與嗜水氣單胞菌（登錄號YP_855090）的AhyR蛋白親緣性最近，自然聚為一支（圖5）。

2.3AhyR基因編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預測進一步分析AhyR蛋白三級結(jié)構(gòu)，確定以群體感應(yīng)控制阻遏物的A鏈（PDB：3SZT_A）為模板，該蛋白與模板相似性達28.40%，通過SWISS-MODEL在線比較建模結(jié)果，如圖6-A所示，AhyR蛋白主要由15個α螺旋、5個β折疊和19個轉(zhuǎn)角構(gòu)成，該三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)序列特征分析結(jié)果基本一致；圖6-B顯示LuxR型螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域主要以α螺旋分布在三級結(jié)構(gòu)C端外側(cè)。拉馬錢德蘭圖檢測結(jié)果（圖7）表明有93.9%氨基酸序列位于最適宜區(qū)，5.9%氨基酸序列位于允許區(qū)，證實AhyR基因推導蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型合理。3討論嗜水氣單胞菌致病因子主要包括外毒素、胞外蛋白酶等，還與轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白AhyR基因有關(guān)［3］。AhyR蛋白在嗜水氣單胞菌蛋白酶活性調(diào)節(jié)中起重要作用，促使胞外蛋白酶較早表達，有效防御病原菌侵入抵制感染［7］。Bi等利用自殺性重組質(zhì)粒pJP-AhyR插入誘變嗜水氣單胞菌J-1菌株AhyR基因，構(gòu)建該基因突變株J-1△AhyR，證實AhyR基因。

作者：李雪  胡秀彩 蘭云 沈曉靜 呂愛軍朱愛華單位：江蘇師范大學生命科學學院