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轉錄調控蛋白基因的克隆范文

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轉錄調控蛋白基因的克隆

《生物技術通報雜志》2014年第七期

1材料與方法

1.1材料

嗜水氣單胞菌Zf1菌株由本實驗室保藏。細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司,pMD18-TVector購自TaKaRa公司,UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、PCR擴增試劑均購自上海捷瑞生物工程公司。

1.2方法

1.2.1引物設計與合成參考嗜水氣單胞菌AhyR基因序列(登錄號:YP_855090),設計特異性上下游引物(AhyR-F:CGATTGCGAAAGCGATAA;AhyR-R:CTGCTGAGCCATTGGTTTT)用于PCR擴增Zf1菌株AhyR基因,引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2Zf1菌株AhyR基因克隆參考李雪等[10]方法,將Zf1菌株接種于LB液體培養基中,28℃培養12h。取1mL菌液用于提取基因組DNA,具體操作參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書。將提取到的基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,-20℃保存備用。PCR擴增采用10μL體系:提取的Zf1菌株基因組DNA模板1.0μL,上下游引物各0.5μL,MasterMix5.0μL,ddH2O3μL。PCR循環條件為:94℃預變性2min,94℃變性45s,50℃退火45s,72℃延伸2min,經30個循環后72℃再延伸10min。得到目的條帶后,按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說明書回收目的基因。將膠回收得到的DN段用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,-20℃保存備用。將AhyR基因膠回收產物與pMD18-T載體連接,轉化到DH5α感受態細胞,陽性克隆菌樣送上海生工測序。

1.2.3基因序列及其結構分析用Editseq推測氨基酸序列,利用MotifScan、blastp程序預測結構域,NetPhos2.0Server預測磷酸化位點。通過鄰接法(Neighbor-Joining),應用MEGA5.1軟件構建系統發育進化樹分析。將蛋白氨基酸序列提交SWISS-MODEL預測三級結構,用RasMolVersion2.7.5.2查看蛋白三級結構,并用拉馬錢德蘭圖(Ramachandranplot)檢測蛋白模型的合理性。

2結果

2.1Zf1菌株AhyR基因克隆及序列分析PCR擴增得到一條特異性條帶(圖1),測序獲得AhyR基因大小為1063bp,引物序列見圖2,推測ORF編碼260aa;查找結構域發現AhyR蛋白18-168aa區域為自體誘導物結合域(PF03472),176-241aa區域為LuxR型螺旋-轉角-螺旋DNA結合結構域(PS50043),183-227aa區域為DNA結合域(PF04967)(圖3);預測AhyR蛋白含有13個磷酸化位點,其中有8個絲氨酸(15S、62S、144S、145S、156S、173S、200S、227S)、3個蘇氨酸(30T、184T、188T、)和2個酪氨酸(161Y、231Y),進一步預測酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(15S、173S、184T、199T)和蛋白激酶C磷酸化位點(173S、184T、210T、222T)(圖4)。

2.2AhyR基因蛋白序列比對及系統進化樹分析對AhyR蛋白進行多重序列比對表明氣單胞屬不同菌種AhyR氨基酸序列高度保守,與殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)、維隆氣單胞菌(A.veronii)、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)、中間氣單胞菌(A.media)、簡達氣單胞菌(A.jandaei)序列同源性分別為100%、99.62%、99.23%、98.85%、94.23%。構建系統發育進化樹分析顯示AhyR為LuxR同源蛋白之一,AhyR蛋白與嗜水氣單胞菌(登錄號YP_855090)的AhyR蛋白親緣性最近,自然聚為一支(圖5)。

2.3AhyR基因編碼蛋白三級結構預測進一步分析AhyR蛋白三級結構,確定以群體感應控制阻遏物的A鏈(PDB:3SZT_A)為模板,該蛋白與模板相似性達28.40%,通過SWISS-MODEL在線比較建模結果,如圖6-A所示,AhyR蛋白主要由15個α螺旋、5個β折疊和19個轉角構成,該三級結構與二級結構序列特征分析結果基本一致;圖6-B顯示LuxR型螺旋-轉角-螺旋結構域主要以α螺旋分布在三級結構C端外側。拉馬錢德蘭圖檢測結果(圖7)表明有93.9%氨基酸序列位于最適宜區,5.9%氨基酸序列位于允許區,證實AhyR基因推導蛋白的三級結構模型合理。3討論嗜水氣單胞菌致病因子主要包括外毒素、胞外蛋白酶等,還與轉錄調控蛋白AhyR基因有關[3]。AhyR蛋白在嗜水氣單胞菌蛋白酶活性調節中起重要作用,促使胞外蛋白酶較早表達,有效防御病原菌侵入抵制感染[7]。Bi等利用自殺性重組質粒pJP-AhyR插入誘變嗜水氣單胞菌J-1菌株AhyR基因,構建該基因突變株J-1△AhyR,證實AhyR基因。

作者:李雪  胡秀彩 蘭云 沈曉靜 呂愛軍朱愛華單位:江蘇師范大學生命科學學院

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