基因載體聚合物研究范文

本站小編為你精心準(zhǔn)備了基因載體聚合物研究參考范文，愿這些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

非病毒基因載體聚合物以其低毒、低免疫原及靶向性等優(yōu)點(diǎn)正成為目前基因治療的熱點(diǎn)之一?；蛑委熓且环N將外源基因?qū)肽康募?xì)胞并有效表達(dá)從而達(dá)到治療目的的方法,優(yōu)良的基因傳遞系統(tǒng)要能包裹并保護(hù)核酸物質(zhì),避免內(nèi)涵體降解,并能專一靶向機(jī)體的靶器官。載體問(wèn)題一直是基因治療研究領(lǐng)域的核心技術(shù)之一,基因載體主要分為病毒載體和非病毒載體兩類。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、皰疹病毒等[1],其優(yōu)點(diǎn)是病原性低、轉(zhuǎn)染率高,但其不僅價(jià)格昂貴,且易引發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)并可能致癌,尤其是安全性低的缺點(diǎn)限制了其在臨床的應(yīng)用。非病毒載體的種類很多,如陽(yáng)離子聚合物、陽(yáng)離子多肽和陽(yáng)離子脂質(zhì)體等[2],具有價(jià)格低、制備簡(jiǎn)單、安全有效、無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn),已漸成為病毒類基因載體的替代者。本文從藥劑學(xué)的角度綜述近年來(lái)非病毒基因載體聚合物的研究現(xiàn)狀,并探討如何優(yōu)化非病毒基因載體聚合物傳遞體系以提高基因治療的療效。

1非病毒基因載體的種類

1.1脂質(zhì)體或脂質(zhì)復(fù)合物

脂質(zhì)體包括陽(yáng)性、中性和陰性脂質(zhì)體,其中陽(yáng)性脂質(zhì)體研究的最為廣泛。自從1987年以來(lái),眾多學(xué)者相繼合成出許多陽(yáng)離子脂質(zhì)體。所有的陽(yáng)離子脂質(zhì)體的一端皆擁有1~2條由12~18個(gè)碳原子組成的疏水鏈,使其在水性介質(zhì)中形成雙層結(jié)構(gòu),并包裹DNA;另一端為親水性的N+,通過(guò)靜電力與DNA結(jié)合以形成脂質(zhì)復(fù)合物。構(gòu)效關(guān)系研究表明[3],增加分子中N+數(shù)目以及N+與疏水鏈的距離,有利于基因轉(zhuǎn)移。脂質(zhì)體或脂質(zhì)復(fù)合物經(jīng)靜脈注射后,很快被血漿清除并在肺組織中積蓄,蛋白質(zhì)主要在肺內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá),通常表達(dá)時(shí)間較短,一般在給藥后4~24h即達(dá)峰,1周后消失。因此,陽(yáng)離子脂質(zhì)載體在治療一些肺部疾病如肺代謝性疾病、門脈高壓和急性呼吸窘迫綜合征等有較好前景。脂質(zhì)體或脂質(zhì)復(fù)合物也可直接應(yīng)用于病變部位以避免靜脈給藥選擇性差的缺點(diǎn)。有研究表明[4],氣管內(nèi)給予野生型Ad-p53凋亡誘導(dǎo)基因可促使肺泡上皮細(xì)胞中的半乳糖苷酶基因的表達(dá)使早期肺部腫瘤縮小,并且可有效地防止脂質(zhì)復(fù)合物中DNA的降解。目前雖然在陽(yáng)離子脂質(zhì)體構(gòu)效關(guān)系研究的基礎(chǔ)上,合成了一些新的脂質(zhì)載體,但離理想的脂質(zhì)載體還相距較遠(yuǎn),其主要困難在于體內(nèi)外轉(zhuǎn)染條件的差別,而且轉(zhuǎn)染效果還取決于給藥途徑。因此,只有根據(jù)實(shí)際的臨床應(yīng)用來(lái)個(gè)性化設(shè)計(jì)才能獲得較為理想的載體,這無(wú)疑給載體的開發(fā)帶來(lái)困難。脂質(zhì)體或脂質(zhì)復(fù)合物并沒(méi)有長(zhǎng)期安全性報(bào)道。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[5],脂質(zhì)體或脂質(zhì)復(fù)合物是無(wú)毒的,而且若給予小劑量,其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)很小;但當(dāng)小鼠呼吸道吸入脂質(zhì)復(fù)合物后,可誘導(dǎo)產(chǎn)生劑量依賴性的肺部炎癥反應(yīng)并伴隨細(xì)胞因子的產(chǎn)生;若靜脈注射給予DNA陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合物,則發(fā)現(xiàn)可激發(fā)細(xì)胞因子如INF和TNF產(chǎn)生。這些細(xì)胞因子不僅引發(fā)毒性,還抑制外源基因的表達(dá),影響療效。

1.2陽(yáng)離子多聚物

1.2.1多聚賴氨酸聚-L-賴氨酸和去唾液酸糖蛋白連接的聚合物用于細(xì)胞的基因靶向轉(zhuǎn)移,其基因轉(zhuǎn)染效果較陽(yáng)離子脂質(zhì)體差。有研究表明[6],在有或無(wú)靶向配體的情況下,多聚賴氨酸與DNA的聚合物的細(xì)胞攝取率和基因轉(zhuǎn)染率都依賴于聚合復(fù)合物正電性的存在。而將組氨酸連接到聚-L-賴氨酸的殘基上形成的聚合物比添加了氯喹的聚-L-賴氨酸混合物更為有效,這可能是由于在pH<6的情況下,質(zhì)子化的組氨酸提供了額外的內(nèi)吞緩沖能力,因此,組氨酸的使用有助于避免DNA在吞噬細(xì)胞中被降解。此外,用半胱氨酸和色氨酸殘基替代聚-L-賴氨酸中的一些氨基酸殘基,會(huì)增強(qiáng)polyplexes的基因轉(zhuǎn)染率,這說(shuō)明DNA的釋放可能受細(xì)胞內(nèi)二巰鍵的還原所激發(fā)。雖然多聚賴氨酸像脂質(zhì)體一樣能阻止血清中核酶對(duì)DNA的降解,但若經(jīng)靜脈注射給藥,聚合物與血漿蛋白結(jié)合后仍將迅速?gòu)难獫{中被清除。

1.2.2聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)PEI陽(yáng)離子聚合物表面的正電荷與DNA上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)產(chǎn)生靜電作用形成復(fù)合物。電鏡觀察顯示[7],復(fù)合物中的多數(shù)質(zhì)粒DNA分子濃縮為孤立的環(huán)狀結(jié)構(gòu),DNA的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,但一級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)變化,仍保留轉(zhuǎn)錄活性。這種復(fù)合物的超分子結(jié)構(gòu)可以描述為一種核-殼結(jié)構(gòu),疏水核是部分中和的DNA,外殼則是親水的陽(yáng)離子聚合物鏈段。這種核-殼結(jié)構(gòu),增加了體系在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性,保護(hù)DNA在傳遞過(guò)程中不受DNA酶或巨噬細(xì)胞的降解。PEI陽(yáng)離子聚合物由于其自身具有緩沖容量,在不需要加入吞噬細(xì)胞或溶酶體溶解劑的情況下就顯示出較好的基因轉(zhuǎn)染效果。PEI也具有細(xì)胞毒性作用,其毒性與相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)有關(guān),不同Mr或異構(gòu)體的PEI,在體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的效果和毒性不同[8]。目前,PEI已用于不同給藥途徑的基因轉(zhuǎn)移如吸入、腎動(dòng)脈內(nèi)給藥、腦內(nèi)注射和靜脈注射,如果在PEI的polyplexes偶聯(lián)上靶向配體將會(huì)增強(qiáng)其轉(zhuǎn)染能力。若用PEG包衣能使其在肺外組織、肝的基因表達(dá)增加,而且還能調(diào)節(jié)PEI的毒性,但是體外攝取有所降低[9]。而不論是靜脈注射,還是氣管內(nèi)給藥,線形PEI的基因表達(dá)皆優(yōu)于陽(yáng)離子脂質(zhì)體。

1.2.3樹突狀聚合物樹突狀聚合物系一定Mr范圍的聚酰胺和含磷樹狀聚合物的末端氨基通過(guò)靜電力與DNA結(jié)合形成的一種陽(yáng)離子多聚物非病毒基因載體[10],聚酰胺樹狀聚合物的酰胺鍵在水或乙醇中的水解,可使基因轉(zhuǎn)染率增加50倍,其原因可能是水解增加了聚合物的柔韌性。故一些可水解的聚酰胺樹狀聚合物對(duì)體內(nèi)頸動(dòng)脈的基因轉(zhuǎn)染比支鏈PEI更有效。Kurtoglu等[11]研究了樹突狀聚合物的載藥特性,結(jié)果表明增加末端氨基的數(shù)目能增加聚合物基因轉(zhuǎn)染的效果,并且還發(fā)現(xiàn),水解的聚酰胺樹狀聚合物對(duì)吞噬細(xì)胞的膨脹作用至關(guān)重要。

1.3殼聚糖載體聚合物

殼聚糖作為一種天然陽(yáng)離子聚合物,通過(guò)與DNA以靜電方式作用使殼聚糖-DNA體系不被降解,完全進(jìn)入細(xì)胞。作為基因載體,殼聚糖具有細(xì)胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低和轉(zhuǎn)染效率較高等特點(diǎn)[12]。研究者對(duì)殼聚糖-DNA復(fù)合物的制備及其生物活性進(jìn)行了大量研究。殼聚糖-DNA復(fù)合物按制備方法主要分殼聚糖及其衍生物的DNA復(fù)合物、殼聚糖-DNA納米微球和殼聚糖自聚體-DNA。有研究表明[13],殼聚糖的Mr、DNA復(fù)合物的N/P值、DNA復(fù)合物顆粒大小和對(duì)殼聚糖的改性及其改性程度是影響這類DNA復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和是否對(duì)特定細(xì)胞具有靶向性的主要因素。殼聚糖載體對(duì)質(zhì)粒DNA有效的凝聚作用和保護(hù)DNA不被核酸酶降解是其它高分子載體無(wú)法比擬的。

1.4無(wú)機(jī)納米粒子載體

應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)運(yùn)的無(wú)機(jī)納米粒子主要包括硅、鐵氧化物、碳納米管、磷酸鈣、金屬納米粒子、量子點(diǎn)等。無(wú)機(jī)納米粒子主要通過(guò)穿過(guò)細(xì)胞膜將藥物或生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)到生物體中而起到治療疾病的作用,其發(fā)揮轉(zhuǎn)染功能的大致過(guò)程有:首先,將DNA和RNA等基因治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面,通過(guò)內(nèi)吞入胞等方式被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)并且被釋放。其次,將DNA導(dǎo)入細(xì)胞核并發(fā)揮功能。一般來(lái)說(shuō),分子都是通過(guò)核孔復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核。核孔復(fù)合物是一個(gè)插入到雙層核膜中的蛋白質(zhì)大分子,允許大約9nm的溶質(zhì)自由通過(guò)。生物大分子或納米粒子通過(guò)核孔則需要信號(hào)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)分子。但目前沒(méi)法確定DNA進(jìn)入細(xì)胞核的確切途徑,學(xué)者們主要傾向于兩種主要理論:一種是納米粒子在內(nèi)涵體或細(xì)胞質(zhì)中被溶解,然后釋放DNA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)核;另一種是攜帶DNA的納米粒子直接到達(dá)細(xì)胞核表面,然后DNA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)核。雖然無(wú)機(jī)納米粒子的材料不同,但其具有濃縮及保護(hù)DNA的作用、較大的核酸裝載容量、優(yōu)良的表面性質(zhì)、極低的免疫原性[14]都賦予了其在基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域巨大的應(yīng)用潛力。

2非病毒基因載體聚合物傳遞體系的優(yōu)化

大多數(shù)非病毒基因傳遞系統(tǒng)的體外基因傳遞過(guò)程如下[15]:細(xì)胞內(nèi)吞、脫離溶酶體、基因DNA進(jìn)入細(xì)胞核。理想的非病毒基因載體聚合物傳遞體系能在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中保持穩(wěn)定,有效地到達(dá)靶向細(xì)胞,并實(shí)現(xiàn)在靶向細(xì)胞內(nèi)的高效安全表達(dá)。通過(guò)對(duì)傳遞體系的優(yōu)化,可提高其在體內(nèi)循環(huán)中的穩(wěn)定性、延長(zhǎng)作用時(shí)間、減少細(xì)胞毒性及提高靶向性,從而提高基因傳遞體系的轉(zhuǎn)染率。

2.1原位交聯(lián)非病毒基因載體聚合物傳遞體系

在生理環(huán)境中,多數(shù)非病毒基因載體聚合物易聚集,很快從體內(nèi)循環(huán)中清除,因而限制其應(yīng)用。分子生物學(xué)的研究表明,病毒基因載體聚合物能保持穩(wěn)定的原因?yàn)榈鞍踪|(zhì)大單體的交聯(lián)。因此,可以通過(guò)聚陽(yáng)離子交聯(lián)制備非病毒基因載體聚合物傳遞體系,以提高其在鹽溶液中的穩(wěn)定性。對(duì)于兩親嵌段共聚物/DNA在水溶液中形成的膠束進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)時(shí),被高度稀釋,如濃度降低到臨界聚集濃度時(shí),膠束就會(huì)解體。通過(guò)嵌段共聚物間的交聯(lián)可有效抑制膠束的解體。PEG-b-PLL是最早采用戊二醛作為交聯(lián)劑的體系,以戊二醛為交聯(lián)劑,雖然提高了膠束的穩(wěn)定性,但卻增加了其毒性。Han等[16]則在PEG-b-PLL中引入-SH,通過(guò)-SH間的交聯(lián)反應(yīng)穩(wěn)定膠束。這類原位交聯(lián)的超分子組裝基因載體極大地提高了基因傳遞體系在鹽溶液中的穩(wěn)定性。

2.2兩親性非病毒基因載體聚合物傳遞體系

絕大多數(shù)聚陽(yáng)離子/DNA聚合物在生理環(huán)境下的溶解度很小,易沉析出來(lái)。通過(guò)在聚陽(yáng)離子中引入親水鏈段(如PEG)合成兩親嵌段或接枝共聚物,作為非病毒基因載體可有效地改善溶解性和細(xì)胞毒性問(wèn)題。

兩親共聚物包括聚陽(yáng)離子鏈段和非離子的親水性鏈段。這類共聚物的合成通常采用兩種方法,一是以端基功能化的親水鏈段作為大分子引發(fā)劑,引發(fā)陽(yáng)離子鏈段的聚合;二是聚陽(yáng)離子鏈段和聚親水鏈段的偶合反應(yīng)。Wang等[17]采用前一種方法合成了一系列的兩親嵌段聚合物。非離子鏈段要求鏈段柔順、低毒性以及低免疫原性,PEG最常被共價(jià)連接到陽(yáng)離子聚合物上。由于PEG具有很強(qiáng)的水合作用,延長(zhǎng)在血液循環(huán)中的時(shí)間,提高靶向細(xì)胞的吸收,且PEG鏈端也可引入各種功能基團(tuán),因而兩親嵌段聚合物是最常用的一類聚合物。聚陽(yáng)離子鏈段的結(jié)構(gòu)對(duì)基因轉(zhuǎn)染效率有很大的影響,如電荷的密度、鏈的柔順性以及疏水性都會(huì)影響與基因分子的作用,從而影響復(fù)合物的穩(wěn)定以及解離。兩親共聚物/DNA聚合物的尺寸、結(jié)構(gòu)及物理化學(xué)性質(zhì)影響相關(guān)基因傳遞體系的體外、體內(nèi)性質(zhì)。ζ電位是關(guān)系到聚合物穩(wěn)定性的一個(gè)重要參數(shù)[18],ζ電位與聚陽(yáng)離子/DNA的比例有關(guān)。由于細(xì)胞膜表面為負(fù)電荷,ζ電位為正的基因傳遞體系,有利于細(xì)胞的內(nèi)吞,因此在體外基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中,通常在陽(yáng)離子聚合物過(guò)量的條件下制備基因傳遞體系。通過(guò)調(diào)節(jié)兩親共聚物的結(jié)構(gòu)和基因載體的制備條件,就可獲得有良好溶解性、穩(wěn)定性及高基因轉(zhuǎn)染率的兩親共聚物/DNA的非病毒基因載體聚合物。

2.3配體增強(qiáng)型非病毒基因載體聚合物傳遞體系在保證治療基因作用的前提下盡量減少給藥劑量,可避免很多不良反應(yīng)。目前,提高基因傳遞體系的靶向性主要是通過(guò)在非病毒基因載體聚合物中引入與靶向細(xì)胞表面富含的受體或蛋白特異性結(jié)合的配體,制備配體增強(qiáng)型的非病毒基因載體聚合物傳遞體系。如半乳糖苷配體能與肝細(xì)胞膜表面的唾液酸糖蛋白受體特異性結(jié)合并介導(dǎo)內(nèi)吞;而葉酸能與癌細(xì)胞表面的受體特異性識(shí)別,在基因治療中常作為癌細(xì)胞的靶向配體。配體的引入有兩種方法:一是采用分子偶聯(lián)方法將配體共價(jià)鍵合到脂質(zhì)體或陽(yáng)離子聚合物上;二是在聚陽(yáng)離子/DNA聚合物中引入含特異性配體的第三組分,使之作為涂層分布于基因傳遞體系的表面。蔣建偉等[19]將糖基共價(jià)連接到PEI中(Gal-PEI),從而使外源DNA導(dǎo)入肝細(xì)胞中并實(shí)現(xiàn)表達(dá)。但透射電鏡顯示在生理環(huán)境下,Gal-PEI/DNA聚合物易發(fā)生集聚,限制了其的應(yīng)用。

3結(jié)語(yǔ)

目前,基因治療已成為醫(yī)藥科研中最活躍的研究領(lǐng)域。藥劑工作者的首要任務(wù)就是設(shè)計(jì)開發(fā)出無(wú)毒、高效的基因治療載體。目前,非病毒基因載體聚合物以其低毒、低免疫原及靶向性等優(yōu)點(diǎn)正在逐漸代替病毒基因載體,但基因轉(zhuǎn)染率仍然較低,因此,設(shè)計(jì)既具有病毒的優(yōu)點(diǎn),又能克服病毒的細(xì)胞毒性和免疫原性人工病毒基因傳遞系統(tǒng)勢(shì)在必行。未來(lái)的基因傳遞系統(tǒng)將被設(shè)計(jì)得更像病毒,具有多功能的基因載體聚合物。隨著高效、安全、靶向的基因傳遞體系的研究開發(fā),基因治療必將得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。