美章網 精品范文 動物實驗的優勢范文

動物實驗的優勢范文

前言:我們精心挑選了數篇優質動物實驗的優勢文章,供您閱讀參考。期待這些文章能為您帶來啟發,助您在寫作的道路上更上一層樓。

動物實驗的優勢

第1篇

關鍵詞:實驗動物學;生物醫學;動物模型

1實驗動物學在國內外發展現狀

由于生物動物學得天獨厚的優勢,很多多家都早早進行了這方面的研究。英國、美國、日本、法國分別在47、50、53、56年成立生物學研究方向中心。聯合國教科文組織與生物科學協會以及醫療科學國際組織聯合在1956年成立了國際實驗動物委員會,現今已經有45個國家參與。在這些國家努力下,實驗動物學的發展十分迅速,甚至早早就設立了獨立的科學研究部門。研究實驗動物學的部門也越發建立起法律、法規逐步完善教育、管理、科研。這樣的有組織的發展,促進了有關生物學的各方面發展。美、日等國家更是專門設立了大規模獨立的研究,用于發展生物實驗。時間來到近些年,很多國家為了加強實驗動物學的發展,都設立的專門的大學來培養人才。醫學院、獸醫院和很多綜合性的大學也孕育而生,為了培養專業的人才,學校都設有高水平、大規模、先進性的設備確保實驗中心的研究工作。動物保護協會在動物實驗中也提出:Replacement(替代)、Reduc-tion(減少)、Refinement(優化)這三個宗旨。提出實驗中盡可能少地使用動物,如果能另尋它法最好。善待動,物對實驗動物飼養和管理盡量以最佳條件,使動物實驗的設計、操作達到最佳的方案。我國實驗動物學的發展近況:我國實驗動物研究學起步較晚,1918年元北平中央防疫處剛開始用小白鼠進行防疫試驗。20世紀30年代,幾個大城市少數的科研單位開始進行小規模的實驗飼養。在解放后實驗動物工作才算正式發展起來,20世紀50年代為預防各大傳染病我國在各地建立起研究單位,并開始大規模的飼養繁殖。1982年我國科委主持召開全國首次實驗動物科技的會議,正式將實驗動物科技加入規劃,先后建立起4個國家級實驗動物中心。1987年成立了中國實驗動物學會。1988國家科委經國務院批準,頒布了《實驗動物管理條例》。1994年國家技術監督局了實驗動物的國家標準,從此我國的生物實驗動物開始走上了科學、標準的軌道。目前,我國科學工作者在實驗動物學方面的研究做了大量工作,當然也取得了很大成就。實驗動物的管理條例也愈發成熟,各級省、市、自治區都成立了實驗動物管理機構。并各大醫學院校設立了實驗動物學課程,一些院校還設立了實驗動物專業,并且招收碩士、博士研究生。中國政府和日本合作開設中國實驗動物培訓中心,培訓出了大批良好的人才。我國培訓這些人才,都為實驗動物科學的發展起到了至關重要的作用。據1995年不完全統計,全國生產大鼠、小鼠、豚鼠、兔、犬、猴、地鼠、豬、SPF雞等實驗動物約900萬只。在數量上大部分地區基本可以滿足科技工作的需要,實驗動物的生產已開始向企業化、商品化、社會化方向發展。

2動物模型的優越性

2.1避免在人身上進行實驗帶來的風險

臨床試驗是最有效果知道試驗結果的醫學方式,但是臨床上外傷、中毒等試驗研究是十分有難度的。還有急性和慢性呼吸系統疾病等不可能在人身上反復試驗的。因此動物可以作為人類的試驗者,在工作人員反復研究下可以反復觀察試驗體的情況進行研究。克服人類在研究中遇到的倫理和社會限制問題,試驗中可能為了試驗需要損傷動物器官或處死動物。

2.2可以嚴格控制實驗條件

臨床上很多疾病是復雜的,就來一個換有腎臟疾病的病人來說,他也同時患有心臟病或肺臟疾病。即使患有同樣疾病的兩個人也會因自身的特點年齡、性別、體重、健康狀態等等原因疾病的發展而產生千差地別的影響。而動物就能克制這些因素的發生,各方面的因素甚至濕度、溫度、私聊方面都能嚴格控制。無論是在營養學、衛生學、腫瘤學、環境等方面,同一時期內很難在人身上取得一定數量的定性疾病材料。動物模型不僅僅在數量上可以得到滿足,而且還可以通過投服一定劑量的藥物或移植。

2.3有利于全面認識疾病的本質

臨床研究多會有局限性,病原體的感染會應為動物的不同而表現出不同的特點。通過人畜感染患病比較研究,可以研究出同一病原體對不同機體帶來各種損害、不良反應。從中工作人員能發現某種疾病的本質,有利于解釋在人體上的病歷變化。動物疾病模型的另一個成效的用途:能仔細觀察環境或遺傳因素對疾病發生后的發展情況,對于全面地認識疾病本質有重要意義。

3結論

第2篇

在初中物理教學中,無論是教師演示實驗還是學生分組實驗經常有失敗現象甚至是事故發生.究其原因,有的是實驗儀器準備不當,沒有考慮器材的適用條件;有的是實驗條件或因素考慮不周,照搬書本理所當然地進行實驗;有的是實驗操作方法不夠熟練,教師在課前未做充分演練;有的是設備故障或遇到偶發事件,實驗無法繼續進行等等.遇到實驗失敗,是遮掩搪塞或一帶而過,還是抓住時機分析失敗原因,是課堂教學中經常遇到的問題.

在課堂寶貴的45分鐘時間內,實驗的失敗經常會讓師生感到沮喪.但是,換個角度看待問題,則可以將課堂教學的“失敗”之處轉變為成功之處,從而朝著有利于物理教學的方向發展.

1 以失敗原因為契機,幫助學生突破知識難點

學生實驗時,教師習慣于給學生做好前期準備工作,強調注意事項,讓學生順著教師的“意圖”進行實驗,從而節省時間,便于得出結論.殊不知,這樣做很可能把一些本該需要突破的教學難點給忽略了,沒有充分利用好實驗機會.所以,針對一些知識難點,教師可以設置一些失敗實驗為教學契機,幫助學生鞏固、加深理解物理知識.

例如,在“探究凸透鏡成像的規律”時,選好透鏡并將器材組裝到光具座上時,要做一個關鍵操作:使燭焰和光屏的中心位于凸透鏡的主光軸上,然后才能進行后面的操作.但很多學生不理解這一步的重要性,為此,筆者在進行本實驗教學時,有意安排了如下教學片斷:讓學生按教師演示的進行操作,將蠟燭、透鏡、光屏從左到右依次組裝在光具座上.先將蠟燭放在距離透鏡較遠處,調節光屏到凸透鏡的距離,使燭焰在光屏上成清晰的像,并注意觀察像的大小、正倒.學生按要求進行實驗時,有一組無論怎么移動光屏,都無法在光屏上得到像,筆者發現他們組裝的儀器如圖1所示,就將該組器材展示給全班學生,并與自己組的比較下,啟發他們找出其中的原因.有學生認為該組的凸透鏡裝的太高了,而燭焰和光屏太低了,應該使三者一樣高.筆者當即表揚該生的發現并請該組學生自己改進實驗裝置.

在探究“分析實驗數據,在什么情況下可以得到倒立、等[HJ1.4mm]大的實像”時,絕大多數小組都能通過實驗發現:當光屏上成倒立、等大的實像時, 可得U=V=2f.但有一組發現上述結論好像不成立,提出了異議,只見他們組裝的器材如圖2所示.筆者將其展示,提問這是為什么?學生議論紛紛,各抒已見,筆者順勢指出:這樣放置,光具座上蠟燭到透鏡的距離并不是實際的物距,實際物距應是燭焰到透鏡中心的距離.經過這樣的原因分析,筆者強調,實驗過程中應注意使燭焰、透鏡中心與光屏中心“等高、共軸”.學生終于知道了實驗失敗的原因所在,事實證明,學生今后對這個問題就不再只知表面不知內因了.

2 以失敗現象為抓手,培養學生分析解決問題的能力

物理課程標準列出了學生必做的一些實驗,而學生實驗的主要目的就在于鼓勵學生積極動手、動腦,體驗學習科學的樂趣.特別是電學實驗,學生實驗的興趣很高,但是失敗的情況也很多,甚至是意想不到的.教師自己要有充分的實驗知識和操作能力,在鼓勵學生自己分析解決問題的同時,必要時點撥或幫助一下學生,讓學生有信心繼續實驗.

例如在進行“測量小燈泡的功率”教學時,學生按照電路圖連接好實驗儀器后,閉合開關,有幾組發現電燈不亮.其中有位學生馬上舉手說“老師,電燈怎么不亮啊”,筆者示意他先自己找找原因.有一組發現電流表和電壓表均有示數,將滑動變阻器的滑片移動一段距離,但電燈就是不亮,反復檢查后顯得很焦急,急欲尋求幫助.這時,筆者給他們點撥,你們用的滑動變阻器是“50 Ω 1.5 A”的,滑片移動一段后,變阻器接入的阻值仍較大,使小電燈兩端的電壓和流過的電流都非常小,所以發現兩表有示數,但小電燈就是不亮.學生再次實驗后恍然大悟,更加投入后面的實驗了.還有一組連好合上開關后,電表、電燈都不工作,將旋鈕接線反復調試幾次都失敗了,甚至換了個小電燈也一樣,筆者順勢提問:我們來探究下電路為什么不通?學生的興趣立即上來了,針對器材一一分析:可能是電源壞了;可能是滑動變阻器斷了;可能是開關斷路;可能導線出問題了……筆者繼續提問:那有什么方法來判斷故障在哪呢?學生開始逐個更換電源、滑動變阻器、開關等器材,電燈還是不亮.最后筆者提示,我們有沒有什么簡單的方法呢?有學生提出用一根導線并聯在各部件的兩端,一個一個地查,終于發現是其中一根導線斷了.換用另一根導線后,實驗就成功了.學生經歷了嘗試解決問題的過程后,動手實驗的積極性提高了,學到了書本沒有的東西,同時也培養了學生耐心分析問題、勇于解決問題的學習能力.

3 以失敗結局為教訓,培養學生嚴謹的科學態度和科學精神

數學家華羅庚說過:失敗是經常的,關鍵是要把每次失敗作為前進的梯子,繼續攀登.學生實驗中,遇到失敗要做到不灰心、不氣餒、不放棄,要積極分析原因,不斷嘗試,努力培養勇于探索的科學實踐精神.

例如,在“探究使用動滑輪的特點”實驗中,學生將幾個鉤碼掛在動滑輪下面后,開始測繩子自由端的拉力.有的組未將彈簧測力計調零就進行測量;有的組受前面定滑輪實驗的影響,斜拉繩子向上運動等等,發現測出的數據都不能得到F=[SX(]G物+G動[]2[SX)]的結論.筆者讓失敗的幾組研讀實驗要求,分析問題出現的原因,改進后重新實驗,取得了較好的實驗效果.類似的例子還很多,一些看似簡單的實驗,如果操作方法不嚴謹,抱著“玩”的心態操作,很容易造成實驗的失敗.又如在“測量小燈泡的電功率”實驗中,不少學生操作太隨意,經常將小燈泡燒壞,然后仍在一旁不管了,其實很多情況下他們連怎么會燒壞都稀里糊涂.教師應該及時抓住這樣的機會進行教育,讓學生認識到實驗操作的規范性、嚴肅性,樹立嚴謹的科學態度和科學素養.另外,在一些測量性實驗中,教師應該教導學生遵守實驗紀律,尊重實驗事實,不要為了得到漂亮的結論而弄虛作假,養成實事求是的科學精神.

第3篇

關鍵詞:動物細胞;無血清培養基;實驗設計

中圖分類號:R-332文獻標識碼:A文章編號:1673-2197(2009)02-0021-03

動物細胞培養技術是當今生物工程領域中的前沿研究課題之一,無論是在基礎研究還是生產實踐方面都得到生物技術界的重視。隨著哺乳動物細胞培養規模的擴大和生物藥物需求的增長,基于細胞及產品特性的無血清培養基的研制已成為細胞工程領域的重要課題。無血清細胞培養技術的研究日益得到人們的重視。近年來,有關無血清培養基的研制和開發得到了迅速發展,推動了基因工程產品及產業的發展。

1 無血清培養基的優勢特點及分類

細胞培養基是細胞體外培養的最重要因素。無血清培養基是繼天然培養基、合成培養基之后的第三類培養基。與傳統的培養基相比,無血清培養基是一種不含有動物血清或其他生物提取液,但仍可以維持細胞在體外較長時間生長、繁殖的一種培養基。無血清培養基由于其組成成分相對清楚,制備過程簡單,在現代生物技術學領域得到廣泛應用。無血清培養技術也是闡明細胞生長、增殖、分化及基因表達調控的基礎研究問題的有力工具。

常規細胞培養基的制備方法是在基礎培養基中添加相應量的血清或組織提取物,其中最常用于培養基的血清是一種組分很不明確的混合物。所以常規血清細胞培養基存在以下缺點:

(1)血清來自于動物體,其對細胞在體外培養時的主要作用是提供生長因子、激素、結合蛋白,并提供保護作用,但同時也有細胞生長抑制因子和毒性因子,所以存在潛在毒性。

(2)由于動物血清提取的局限,使其應用于培養基的價格格外昂貴。

(3)動物血清提取的局限,也給細胞培養的標準化帶來困難,同時也存在細胞培養表達產品分離純化難的問題,具有潛在的細胞毒性作用,給規?;囵B細胞增加了難度[1]。

由于上述常規血清細胞培養基存在的諸多問題,促使我們改進培養方法,用無血清細胞培養基來替代。細胞工程中無血清培養技術的應用,在很大程度上可以避免含血清培養所帶來的不利。無血清培養基具有以下明顯的優缺點:

無血清培養基的優點:

(1)可避免血清批次間的質量變動,提高細胞培養和實驗結果的重復性。

(2)避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染。

(3)避免血清組分對實驗研究的影響。

(4)有利于體外培養細胞的分化。

(5)可提高產品的表達水平并使細胞產品易于純化。

缺點:

(1)細胞在無血清培養基中易受某些機械因素和化學因素的影響,培養基的保存和應用不如傳統的合成培養基方便。

(2)成本較高。

(3)針對性很強,一種無血清培養基僅適合某一類細胞的培養。

發展無血清培養基,除了開發化學合成培養基外,也可以尋找適當的具有類似于血清功能的生物分子來替代血清。目前,無血清培養基的研究有兩個方向:一是培養基中不含有任何動物來源的添加組分;二是培養基中不含有不明確的添加組分。依次可以將當前應用較多的無血清培養基歸納為以下4種:

(1)無血清培養基。此為一般意義上的無血清培養基,是由各類可替代血清功能的生物材料配制成的細胞培養基,如牛血清白蛋白(BSA)、轉鐵蛋白、胰島素等生物大分子物質,以及從血清中提取的去除蛋白質的混合脂類以及水解蛋白等。其特點是培養基中的蛋白含量較高,添加物質的化學成分不明確,其中含有大量的動物來源蛋白[2]。

(2)無動物來源培養基。許多商業公司開發的無動物來源培養基是基于生產重組藥物的安全考慮,培養基中的添加組分無動物來源,需要的蛋白來源于重組蛋白或者蛋白水解物,這些組分可以保障細胞生長及增殖的需要。

(3)無動物蛋白培養基。培養基完全不用動物來源的蛋白,但仍有部分添加物是來源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此類培養基組分相對穩定,但必須添加類固醇激素和脂類前體,并且對培養的細胞是高度特異性的[3]。

(4)化學組分限定培養基[4,5]。此類培養基是目前最安全、最為理想的培養基,首先可以保證培養基批次間的一致性,其中所添加的少量動物來源的蛋白水解物、蛋白都是成分明確的組份。其特點是培養基的性質明確,有利于進行細胞培養的代謝研究,同時分離純化也比較方便。

2 無血清培養基的實驗研究

無血清培養基是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎培養基加少量血清所配制的完全培養基可以滿足大部分細胞培養的要求,但對有些實驗卻不適合,如觀察一種生長因子對某種細胞的作用,這時需要排除其他生長因子的干擾作用,而血清中可能含有各種生長因子;又如需要測定某種細胞在培養過程中分泌某種物質(抗體、生長因子)的能力;或者要大規模的培養某種細胞,以獲得它們的分泌產物。

2.1 無血清培養基的基本配方

基本成分為基礎培養基及添加組分兩大部分。用于生物制藥和疫苗生產的細胞在體外培養時,多數呈貼壁生長或兼性貼壁生長;而當其在無血清、無蛋白培養基中生長時,由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白,細胞往往以懸浮形式生長。

2.2 添加組分

2.2.1 促貼壁物質

許多細胞必須貼壁才能生長,這種情況下無血清培養基中一定要添加促貼壁和擴展因子,一般為細胞外基質,如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子,對許多細胞的繁殖和分化,起著重要作用。纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化,這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質細胞、CHO細胞、成肌細胞等。

2.2.2 促生長因子及激素

針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質,有些激素是許多細胞必不可少的,如胰島素。

2.2.3 酶抑制劑

培養貼壁生長的細胞,需要用胰酶消化傳代,在無血清培養基中酶抑制劑必不可少,以終止酶的消化作用,達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制劑。

2.2.4 結合蛋白和轉運蛋白

常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大,可增加培養基的粘度,保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養的無血清培養基都含有牛血清白蛋白。

2.2.5 微量元素

硒是最常見的微量元素。

2.3 使用方法

目前,血清仍是動物細胞培養中最基本的添加物,尤其是在原代培養或者細胞生長狀況不良時,常常會先使用有血清的培養液進行培養,待細胞生長旺盛以后,再換成無血清培養液。細胞轉入無血清培養基培養要有一個適應過程,一般要逐步降低血清濃度,從10%減少到5%,3%、1%,直至無血清培養。在降低過程中要注意觀察細胞形態是否發生變化,是否有部分細胞死亡,存活細胞是否還保持原有的功能和生物學特性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續保留,很少有細胞能夠長期培養于無血清培養基而不發生改變的。細胞轉入無血清培養之前,要留有種子細胞,種子細胞按常規培養于含血清的培養基中,以保證細胞的特性不發生變化。

為了使細胞適應無血清培養,關鍵是使所培養細胞處于如下狀況:

(1)處于對數生長中期;

(2)>90%活細胞率;

(3)適應時以較高的起始細胞接種。

細胞適應無血清培養基的方法:

直接適應――細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基(SFM)中。

一些類型細胞可直接從包含血清的培養基適應無血清培養基。對于直接適應,接種細胞密度應該:2.5×105-3.5×105細胞/mL。當細胞密度達到1×106-3×106細胞/mL時,傳代培養細胞。當細胞密度在培養4~7天后達到2×106~4×106細胞/mL時,細胞完全適應了無血清培養基。每隔3~5天,當細胞密度達到1×106~3×106細胞/mL,細胞活率在90%時,貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。

連續適應――分好幾步把細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基(SFM)中,與直接適應相比較,連續適應趨向對于細胞更加溫和一些。

(1)以2倍正常接種密度接種生長活躍的細胞培養物到75%有血清培養基-25%SFM混合培養基中,傳代培養。

(2)當細胞密度>5×105細胞/mL時,以2×105~3×105細胞/mL細胞密度,在有血清培養基:SFM為50∶50的混合培養基中傳代培養。

(3)以2×106~3×106細胞/ml細胞密度,25%有血清培養基和75%SFM中傳代培養。

(4)當細胞密度達到1×106~3×106細胞/mL(接種后4~6天),在100%SFM培養基中傳代培養。

(5)每隔3~5天,當細胞密度達到1×106~3×106細胞/mL,細胞活率在90%時,貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。

建議備份前一次混合培養的培養物,直到每一次細胞適應了新的混合培養基。每一次減少血清前,可能需要在SFM/有血清混合培養基中進行幾次傳代。

在適應過程中,最好不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意,與有血清培養基相比,大部分SFM包含非常少的蛋白質,因而更易于受外界因素的影響。

細胞培養適應替代血清:許多細胞利用連續適應方法能很好的適應,用包含FBS的培養基和包含有替代血清的培養基1∶1(v∶v)的混合培養基培養細胞。通過下列的混合培養基的方式,連續幾代減少當前培養基的量:從1∶2到1∶4再到1∶16直至100%替代培養基。每次適應改變血清比例時,傳代細胞2~3次。

培養直接從FBS轉換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清,生長的延遲可能會發生,允許進行2~3次的傳代,使生長率恢復到以前的水平。

特別需要強調的是:配制無血清培養液必須使用高質量的水,如石英玻璃蒸餾器經3次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無血清培養基缺乏血清中天然成分未中和毒素、保護細胞的大分子,既便水中的有毒物質含量甚微,也可能對細胞產生致死性損害。這是無血清培養能否成功的關鍵因素之一。

3 結語

動物細胞無血清培養基的研究方法運用了基因組技術、蛋白質組技術、代謝工程技術、計量分析方法等。另外,有關無血清培養基在線數據庫的建立也方便了相關信息的檢索與分析[6],為無血清培養基的設計提供了更多的信息。

隨著重組蛋白、單克隆抗體及病毒疫苗需求量的加大,將會有更多的科學方法運用到細胞培養基的設計與研究中[7]。新一代動物細胞無血清培養基將具有“無血清、無蛋白、無動物來源、成分確定”的特性,同時在功能上屬于安全、通用的高效培養基,這種細胞無血清培養基在細胞工程領域中將會得到廣泛應用。

參考文獻:

[1] Even M S,Sandusky C B,Barnard N D. Serum-free hydridoma culture:ethical,scientific and safety considerations[J]. Trends in Biotechnology,2006,24(3):105-108.

[2] Keen M J,Rapson N T. Development of a serum-free culture medium for the large scale production of recombinant protein from a Chinese hamster ovary cell line[J]. Cytotechnology,1995,17 (3) :153-163.

[3] Schroder M, Matischak K, Friedl P. Serum-and protein-free media formulations for the Chinese hamster ovary cell line DUKXB11[J]. Journal of Biotechnology,2004, 108 (3): 179-292.

[4] Hesse F, Wanger R. Developments and improvements in the manufacturing of human therapeutics with mammalian cell cultures[J]. Trends Biotechnology,2000, 18 (4): 173-180.

[5] Chen Z L, Iding K, Lutkemeyer D, et al. A low-cost chemically defined protein free medium for a recombinant CHO cell line producing prothrombin[J]. Biotechnology Letters,2000, 22 (10): 837-841.

主站蜘蛛池模板: 久久亚洲精品中文字幕三区| 免费无码又爽又高潮视频| 91精品国产欧美一区二区| 成人精品免费视频在线观看| 九九久久99综合一区二区| 正在播放露脸一区| 午夜理论影院第九电影院| 青草国产精品久久久久久| 国产精品久久久久久久网站| 99久久综合狠狠综合久久| 少妇特殊按摩高潮惨叫无码| 久久中文字幕人妻丝袜| 日韩超碰人人爽人人做人人添| 亚洲欧洲美洲无码精品VA| 男人进女人下面全黄大色视频| 四虎成人国产精品视频| 香蕉伊思人在线精品| 国产男女猛视频在线观看| 91不卡在线精品国产| 大佬和我的365天2在线观看| 一本色道久久88加勒比—综合| 日日干夜夜操s8| 久久精品国产亚洲| 欧美VA久久久噜噜噜久久| 亚洲日韩久久综合中文字幕| 特级做a爰片毛片免费看一区 | 91在线国内在线播放老师| 天堂资源在线官网| 一二三四视频免费视频 | 国产精品污视频| 99re热这里只有精品视频| 好吊妞视频haodiaoniucom| 中文字幕一区二区三区日韩精品| 日本在线免费看片| 久久精品国产精品亚洲毛片| 极品少妇被猛的白浆直喷白浆| 亚洲另类激情专区小说图片| 欧美日韩精品久久久免费观看 | 久久九九国产精品怡红院| 日韩精品无码人成视频手机| 亚洲av日韩av欧v在线天堂|