檢測鑒定報告范文

前言：我們精心挑選了數(shù)篇優(yōu)質(zhì)檢測鑒定報告文章，供您閱讀參考。期待這些文章能為您帶來啟發(fā)，助您在寫作的道路上更上一層樓。

第1篇

（一）測量過程簡述

（1）測量依據(jù)：JJG 700—1999《氣相色譜儀檢定規(guī)程》。

（2）測量環(huán)境條件：溫度（15～25）℃，相對濕度40％～68％。

（3）測量標(biāo)準(zhǔn)：江蘇省計量科學(xué)研究院提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。具體為氮中甲烷標(biāo)準(zhǔn)氣體。

（4）被量對象：氣相色譜儀。

（5）測量方法：氣相色譜儀（以下簡稱儀器）是在規(guī)定了儀器載氣流速穩(wěn)定性、柱箱溫度穩(wěn)定性、程序升溫穩(wěn)定性的情況下，用微量注射器注入一定體積的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，利用試樣中各組分在色譜柱中的氣相和固定相間的分配及吸附系數(shù)不同，由載氣把氣體試樣或汽化后的試樣帶入色譜柱中進(jìn)行分離，并通過檢測器進(jìn)行檢測的儀器。根據(jù)各組分的保留時間和響應(yīng)值進(jìn)行定性/定量分析。

（6）評定結(jié)果的使用：在符合上述條件下的測量結(jié)果，一般可參照使用本不確定度的評定方法。

（二）數(shù)學(xué)模型

火焰離子化檢測器（FID）

＝ (2)

式中：FID的檢測限（g/s）；

基線噪聲，（mV）；

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的進(jìn)樣量，（g）；

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中溶質(zhì)的峰面積，（mV·s）；

（三）各輸入量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評定

對某臺氣相色譜儀檢測器為TCD的儀器，在室溫（25±1）℃的環(huán)境下進(jìn)行檢定。

1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評定

氮中甲烷標(biāo)準(zhǔn)氣體相對不確定度通常由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書給出，其定值不確定度為1.5％，包含因子＝2，則：

＝0.015/2＝0.0075

2微量注射器校準(zhǔn)值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評定

微量注射器的體積刻度是重要的不確定度來源之一，所以，微量注射器必須經(jīng)校準(zhǔn)后才能使用。根據(jù)上級校準(zhǔn)證書中給出的測量不確定度為0.5%，k=2,則

＝0.005/2＝0.0025

3 峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評定

峰面積或峰高測量不確定度主要為進(jìn)樣的進(jìn)樣的重復(fù)性，規(guī)程規(guī)定進(jìn)樣6次,定量重復(fù)性為不大于3%，則：

＝0.03/＝0.0122

4基線噪聲測量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評定

對于工作站而言，基線噪聲引起的一般為0.01。

（四）合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度的評定

1靈敏系數(shù)

數(shù)學(xué)模型： ＝

靈敏系數(shù)： ＝1 ＝1＝－1

2各不確定度分量匯總及計算表

各不確定度分量匯總及計算表

5擴(kuò)展不確定度的評定

第2篇

[關(guān)鍵詞]果蠅S2細(xì)胞；熒光素酶；啟動子；報告基因；轉(zhuǎn)染

在研究基因功能的過程中，不可避免地要研究基因的調(diào)控機(jī)制，而基因的表達(dá)產(chǎn)物復(fù)雜且難以對其定量和定性，要在細(xì)胞生長周期的任意點了解細(xì)胞的基因表達(dá)產(chǎn)物更是非常困難。但報告基因分析系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)給基因調(diào)控與表達(dá)的研究帶來了新的希望。近年來，報告基因系統(tǒng)的研究取得了快速的發(fā)展。報告基因是一種編碼某種易于檢測蛋白質(zhì)或酶的基因，通過它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，因此，對真核基因調(diào)控的了解可以不通過直接測定調(diào)控元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速率的能力，而是把順式調(diào)控元件與報告基因的序列連接起來，在基因轉(zhuǎn)錄的過程中測定報告基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)量，從而判斷相應(yīng)的順式作用元件的調(diào)控能力。作為報告基因必須具備以下特點：（1）由原核基因編碼的基因產(chǎn)物必須區(qū)別于轉(zhuǎn)染前真核細(xì)胞內(nèi)任何相似的產(chǎn)物；（2）細(xì)胞內(nèi)其他基因產(chǎn)物不會干擾報告基因產(chǎn)物的檢測；（3）報告基因編碼產(chǎn)物的檢測應(yīng)該快速、簡便、靈敏度高、重復(fù)性好。該技術(shù)的主要優(yōu)點是靈敏度高、可信性大及檢測方便且適合大規(guī)模檢測，目前已廣泛應(yīng)用于啟動子分析、監(jiān)控轉(zhuǎn)基因及其表達(dá)、細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與藥物的篩選等多種細(xì)胞事件[13]。熒光素酶（LUC）報告基因來源于北美螢火蟲，能催化螢火蟲的氧化性羧化作用，同時發(fā)射出光子，可被光度計捕獲定量。LUC的分析具有快速、方便、線性較好等優(yōu)點，正成為最廣泛使用的報告基因。pGL3系列的質(zhì)粒就是帶有LUC報告基因的質(zhì)粒載體，我們可以利用這一系列的工具載體研究果蠅中基因的表達(dá)調(diào)控方式，其中pGL3Control帶有SV40的啟動子和增強(qiáng)子。SV40是一種猴病毒， 它的增強(qiáng)子/啟動子區(qū)域可使其在大多數(shù)細(xì)胞株中有高度的組成性表達(dá)，因而廣泛用于構(gòu)建真核基因的表達(dá)載體，因此pGL3Control可作為檢測體系中的陽性對照。但由于SV40啟動子在果蠅S2細(xì)胞中不表達(dá)，所以我們將果蠅actin 5C 蛋白的啟動子（pac）[4]構(gòu)建到質(zhì)粒pGL3Basic中，得到了高表達(dá)LUC的重組載體pGL3pac。這一質(zhì)粒的構(gòu)建可為研究果蠅中基因的調(diào)控方式奠定基礎(chǔ)，同時也可為研究其他報告基因在不同細(xì)胞中的表達(dá)提供借鑒作用。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑大腸桿菌DH5α（作者所在實驗室保存），質(zhì)粒pGL3Basic(Promega公司)，pAc5.1/V5His/LacZ(Invitrogen公司)，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、HindⅢ及T4連接酶、DNA聚合酶(TaKaRa公司)，小量膠回收試劑盒(TaKaRa公司)，中量質(zhì)粒抽提試劑盒(Invitrogen公司)，LUC檢測試劑盒(Promega公司)，S2細(xì)胞Schneider培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，胎牛血清（Gibco公司）。

12 方法

1.2.1 pac啟動子的獲得 以pAc5.1/V5His/LacZ質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物5′GCGCCTCGAGCTTCAAGGAATTAATTCTATATTCT3′，下游引物5′GCGCAAGCTTGGTCTCTGGATTAGACGACT3′（劃線部分分別為XhoⅠ和HindⅢ酶切位點）。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建鑒定與中量抽提純化 PCR產(chǎn)物分別經(jīng)XhoⅠ、HindⅢ雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收酶切片段，與同樣經(jīng)酶切、割膠回收的pGL3Basic質(zhì)粒于16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并涂布于含氨芐青霉素（終質(zhì)量濃度為50 mg?L-1）的固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑陽性克隆提取質(zhì)粒，酶切和測序鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒經(jīng)中量質(zhì)粒抽提試劑盒提取純化。

1.2.3 S2細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時轉(zhuǎn)染 S2細(xì)胞由本實驗室凍存，使用Schneider培養(yǎng)基，補(bǔ)以10%胎牛血清。S2細(xì)胞培養(yǎng)在28 ℃無CO2培養(yǎng)箱中，根據(jù)其生長狀態(tài)，按一定比例每3 d傳代1次。待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染分析。轉(zhuǎn)染時在12孔板中接種1×106個細(xì)胞，加入1 ml含10%胎牛血清的Schneider培養(yǎng)基，置28 ℃無CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～16 h[細(xì)胞生長至對數(shù)生長期達(dá)（2～4）×106ml-1]，在1.5 ml Eppendorf 管中準(zhǔn)備以下試劑：溶液A，12 μl 2 mol?L-1 CaCl2，5 μg重組質(zhì)粒，1 μg pAcLacZ質(zhì)粒，加入雙蒸水至總體積為100 μl，混勻待用；溶液B，100 μl2×HBS。將A溶液緩慢加入B溶液中，輕輕混勻，室溫放置30 min，以形成Ca3PO4DNA復(fù)合物。將Ca3PO4DNA復(fù)合物逐滴加至細(xì)胞上，混勻后置28 ℃無CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后用含10%胎牛血清的Schneider培養(yǎng)基給細(xì)胞換液。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后裂解細(xì)胞，先吸去培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，在每個培養(yǎng)孔中加入200 μl Reporter lysis buffer，保證充分覆蓋細(xì)胞，凍融1次以確保細(xì)胞裂解，將細(xì)胞裂解液移至1.5 ml Eppendorf管中，振蕩10～15 s，離心（12 000×g，2 min，4 ℃），轉(zhuǎn)移上清于新管。制備好的細(xì)胞裂解液可用于測定或貯存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 LUC和β半乳糖苷酶(βgal)活性測定 取制備好的細(xì)胞裂解液進(jìn)行LUC和βgal活性的測定。LUC活性測定前取20 μl平衡至室溫的細(xì)胞裂解液，加入80 μl LUC底物，迅速混勻，置光度計中，記錄讀數(shù)。βgal活性測定根據(jù)分子克隆的方法，在每個用于測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物的Eppendorf管中加入100×Mg2+ 3 μl、1×ONPG 66 μl、細(xì)胞裂解物30 μl、0.1 mol?L-1Na3PO4 201 μl，混勻。置37 ℃保溫30 min，以500 μl 1 mol?L-1 Na2CO3終止顯色反應(yīng)。置酶標(biāo)儀上，在波長420 nm處讀光吸收值來表示βgal的活性，以共轉(zhuǎn)化的βgal活性作為內(nèi)源對照，以/βgal活性的值為系數(shù)，比較各組在轉(zhuǎn)化效率相同時LUC活性的相互關(guān)系。以沒有任何插入片段時pGL3Basic的LUC活性為1，比較加上插入片段pac啟動子后的LUC活性增加的倍數(shù)，即LUC的相對活性，以反映LUC基因表達(dá)的相對水平。

2 結(jié)

果

2.1 重組載體的構(gòu)建鑒定與純化以pAc5.1/V5His/LacZ質(zhì)粒為模板，通過上游引物和下游引物PCR擴(kuò)增獲得pac啟動子2 500 bp基因片段（圖1），用XhoⅠ、HindⅢ雙酶切后克隆到載體pGL3Basic中（圖2）。提取重組陽性質(zhì)粒，XhoⅠ、HindⅢ雙酶切后得到2 500 bp的基因片段（圖1）。經(jīng)測序鑒定，閱讀框架不變。鑒定完成的重組質(zhì)粒經(jīng)過質(zhì)粒中量抽提試劑盒提取純化，得到符合轉(zhuǎn)染所需的高純度高濃度的重組質(zhì)粒pGL3pac，經(jīng)測定其260 nm的OD值，計算得到其濃度為0.99 μg?μl-1，A260 nm/A280 nm為1.81。

2.2 S2細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染分析轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，pGL3Basic和pGL3Control中LUC的相對活性無明顯差異，提示SV40啟動子在果蠅S2細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。而pGL3pac中插入了pac啟動子，LUC的相對活性明顯增高。pGL3pac在果蠅S2細(xì)胞中LUC的活性是pGL3Basic LUC活性的近2.7萬倍。見表1。表1 瞬時轉(zhuǎn)染后各組分酶活性值

3 討

論

LUC是現(xiàn)在常用的一種報告基因，因其無放射性、檢測快、靈敏度高、半衰期短、線性好等特點而得到廣泛的應(yīng)用。我們構(gòu)建了pGL3pac這一重組質(zhì)粒，使得在果蠅S2細(xì)胞中能夠高表達(dá)LUC，為進(jìn)一步的實驗提供了一個好的工具。首先，它可作為基因啟動子分析研究中的陽性對照，通過與該重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染結(jié)果比較，從而判定不同順式作用元件對轉(zhuǎn)錄的影響。其次，我們可以將目的基因某一區(qū)域的啟動子元件插入到重組質(zhì)粒pGL3pac啟動子的上游或下游，通過LUC表達(dá)量改變的放大作用，進(jìn)一步分析這些啟動子元件的生物學(xué)作用，找到在轉(zhuǎn)錄過程中起到關(guān)鍵作用的核心啟動子序列。在此基礎(chǔ)上，我們還可以了解特定的反式作用因子對基因表達(dá)的影響。再次，還可以將目的基因自身的5′端或3′端的UTR序列插入到LUC基因的上下游，通過檢測LUC的水平，為翻譯水平的調(diào)控提供依據(jù)。在實驗過程中，有很多方面值得我們注意。第一，在重組質(zhì)粒利用中量試劑盒抽提純化時，想得到濃度高的產(chǎn)物，應(yīng)注意在菌液的培養(yǎng)量和培養(yǎng)時間上進(jìn)行調(diào)整。因?qū)嶋H環(huán)境的不同，按照操作說明所示的條件往往難以得到足夠的質(zhì)粒量，通過增加培養(yǎng)的菌液量和延長培養(yǎng)時間可取得很好的效果。由于所得的質(zhì)粒是細(xì)胞轉(zhuǎn)染所需，故在抽提純化時應(yīng)特別強(qiáng)調(diào)無菌的原則。第二，在轉(zhuǎn)染實驗中，重組質(zhì)粒pGL3pac必須共同轉(zhuǎn)染表達(dá)另外一帶有報告基因的質(zhì)粒以衡量轉(zhuǎn)染效率。我們選擇了pAcLacZ，該質(zhì)粒含lacZ基因，能夠表達(dá)βgal，利用βgal水解底物ONPG的能力計算出βgal的活性，以此作為內(nèi)源對照衡量不同組分的轉(zhuǎn)染效率。這個質(zhì)粒與目的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染比例對于結(jié)果有很大的影響。因βgal的活性在0.2～0.8之間符合線性范圍，所以可根據(jù)這一要求摸索合適的轉(zhuǎn)染比例，通過實驗可得出兩者在5∶1濃度比時較合適。另外，還可以選擇帶有其它報告基因的質(zhì)粒載體，如phRL是一種帶有海腎熒光素酶（RLUC）報告基因的質(zhì)粒載體，如果選擇phRL作為共轉(zhuǎn)質(zhì)粒則可通過在一管細(xì)胞裂解液中先后加入不同的底物，用同種儀器測定酶的活性即可，因其測定的兩種酶的活性在同一數(shù)量級而且減少實驗步驟，使實驗數(shù)據(jù)更加可靠，實驗過程更加簡便[5]。第三，我們是通過瞬時轉(zhuǎn)染得出結(jié)論，為排除一些因素的影響，轉(zhuǎn)染實驗必須重復(fù)3或4次，本實驗的轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)即是3次實驗的平均值。在實驗中我們選擇了pac替代pGL3Control中的SV40啟動子，主要是因為果蠅actin 5C蛋白組在果蠅體內(nèi)為組成性表達(dá)且不需誘導(dǎo)，因此，利用pac作為替換啟動子，不僅能產(chǎn)生較好的效果而且可簡化實驗操作。這一質(zhì)粒的構(gòu)建不僅為我們在細(xì)胞水平利用報告基因系統(tǒng)研究果蠅中基因的表達(dá)調(diào)控方式提供工具載體，而且它的構(gòu)建方法提示我們可通過相同的途徑構(gòu)建適合轉(zhuǎn)染不同類型細(xì)胞的帶有報告基因的質(zhì)粒載體，作為相應(yīng)研究的基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]LOUISE H. Reporter gene technology：the future looks bright [J].Biochem Pharmacol，1999，58:749757.

[2]GAMBHIR S S，BARRIO J R，HERSCHMAN H R，et al. Assays for noninvasive imaging of reporter gene expression [J]. Nucl Med Biol，1999，26：481490.

[3]LECLERC G M，BOOCKFOR F R，F(xiàn)AUGHT W J，et al.Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression [J].Biotechniques，2000，29:590596.

第3篇

下載百寶箱4.0（2007版下載地址：/dispbbs.asp?boardid=1&id=263514，快車代碼：CF0803CMBG01），解壓縮。點擊Excel 2007左上角的圓形“Office按鈕”，打開選項設(shè)置窗口，在左邊切換到“信任中心”下，點擊“信任設(shè)置”按鈕，在“受信任位置”標(biāo)簽頁下，點擊“添加新位置”按鈕，在“路徑”后定位到剛才保存的百寶箱文件夾，同時勾選“同時信任該文件的子文件夾”，確定后將百寶箱添加到信任列表，確定（見圖1）。

圖1

接下來將百寶箱加載進(jìn)來。為了便于加載宏，我們將按鈕放到快速啟動欄上。在左上角的快速啟動欄上右擊鼠標(biāo)，選擇“自定義快速訪問工具欄”，選擇“不在功能區(qū)的命令”，在下邊的列表中找到“加載宏”，點擊“添加”將其加入到右邊列表中，確定，就將“加載宏”圖標(biāo)放到了快速啟動工具欄上。點擊快速啟動欄上的“加載宏”按鈕，定位到剛才解壓出來的“百寶箱”文件夾中的加載宏文件，確定，Excel 2007的菜單欄就多出一個“百寶箱”的選項卡，里面有“基礎(chǔ)強(qiáng)化工具”、“圖標(biāo)工具箱”、“一鍵工具箱”以及“系統(tǒng)工具箱”等選項組，很多小工具等著來幫你（見圖2、圖3）。

圖2

圖3

小提示：“百寶箱”的寶貝件件數(shù)

“百寶箱”的實用功能還很多，比如特殊選定、快速為工作表建立鏈接目錄、批量添加上下標(biāo)（加解密、個性批注、導(dǎo)入圖片和隱藏）、查看磁盤剩余空間、合并居中還原、設(shè)置與取消允許編輯區(qū)、一鍵修復(fù)（減肥、簡繁轉(zhuǎn)換、刪除超鏈接、刪除選區(qū)批注、生成字母序列）、清除代碼注釋行、生成2003樣式菜單、身份證信息函數(shù)等。