腦膜炎奈瑟菌的檢測技術(shù)和檢測進展范文

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關(guān)鍵詞：流行性腦脊髓膜炎；腦膜炎奈瑟菌；實驗室技術(shù)

流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦）是由腦膜炎奈瑟菌（Nm）通過呼吸道傳播引起的化膿性腦膜炎，為急性呼吸道傳染病，常在冬春季引起發(fā)病與流行。腦膜炎發(fā)病迅速，病死率超過20％，且后遺癥嚴重［1］。我國90％以上的患者是由A群Nm引起。Nm是只存在于人體的需氧雙球菌，其外膜含脂多糖成分，致病性Nm的外膜外有莢膜多糖。Nm有多基因差異。根據(jù)Nm莢膜多糖的不同，分為12個血清群：A、B、C、H、I、K、L、X、Y、Z、29E、W135和不能分群菌株。Nm的病原學(xué)檢測包括細菌培養(yǎng)、革蘭染色、生化鑒定、血清學(xué)分群，乳膠凝集反應(yīng)直接檢測抗原等。腦脊液革蘭染色仍是快速檢測Nm的重要方法之一，患者淤點（斑）、腦脊液涂片檢測時在中性粒細胞內(nèi)見到革蘭陰性腎形雙球菌或腦脊液、血液培養(yǎng)Nm陽性或腦脊液、血液Nm特異性核酸片段檢測陽性都可作為流腦的確診依據(jù)。病原學(xué)檢測是檢驗Nm的傳統(tǒng)方法，但因Nm對冷、熱、干燥和化學(xué)消毒劑的高度敏感性和對外環(huán)境的弱抵抗力，以及臨床標本的采集、運送、培養(yǎng)、接種方式、培養(yǎng)基質(zhì)量、檢測人員的經(jīng)驗等都可能影響檢驗結(jié)果的準確性。PCR分子學(xué)診斷的優(yōu)點是可測出菌群特異性NmDNA，不要求陽性結(jié)果中存在活的病原體，且結(jié)果可在2h內(nèi)獲得［2］。目前，高敏感性、高特異性、操作簡便的分子生物學(xué)檢驗技術(shù)已廣泛應(yīng)用于Nm感染的檢驗診斷。本文就Nm的檢測技術(shù)及檢測進展作初步綜述。

1Nm的病原學(xué)檢測技術(shù)

病原學(xué)檢測是最早應(yīng)用于細菌檢測的方法。分離出Nm是診斷流腦的“金標準”，其鑒定方法包括革蘭染色、氧化酶試驗、生化鑒定、血清學(xué)分群等。基于獲得的陽性菌株，可進行進一步的研究，比如體外藥物敏感試驗就必須首先分離到陽性菌株。李馬超等［3］就曾對其實驗室2005－2006年分離的49株Nm菌株（16株A群、33株C群）進行體外抗菌藥物敏感性檢測，結(jié)果表明，16株A群Nm菌株對復(fù)方磺胺甲噁唑、四環(huán)素、左氧氟沙星、萘啶酸4種抗菌藥物耐藥，對環(huán)丙沙星耐藥或中度敏感，33株C群Nm菌株對復(fù)方磺胺甲噁唑耐藥，31株（93．9％）C群菌株對萘啶酸耐藥，20株（60．6％）C群菌株對左氧氟沙星耐藥，17株（51．5％）C群菌株對環(huán)丙沙星耐藥，4株A群和1株C群Nm菌對青霉素不敏感。馮君平等［4］進一步探索了A群、C群Nm的最適培養(yǎng)基，結(jié)果表明添加酵母浸出粉的培養(yǎng)基可作為A群、C群Nm培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。鄭春早等［5］配制了一種小牛血清“雙抗”培養(yǎng)基作為Nm的增菌培養(yǎng)基，與常規(guī)檢測培養(yǎng)基比較表明，應(yīng)用小牛血清“雙抗”培養(yǎng)基建立的新方法適用于A、B、C群Nm的檢測，且檢測效果明顯優(yōu)于常規(guī)的咽拭子直接接種法。病原學(xué)檢測的缺點是比較繁瑣、耗時、影響因素多，特異性可能不夠好。

2Nm的普通聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

PCR是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，對于不能用血清學(xué)分群的Nm疑似菌株或無法進行Nm分離培養(yǎng)的腦脊液、血液、血清標本可采用PCR進行DNA擴增輔助檢測鑒定。近年來PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于Nm的檢測中［2，6］。黃亮等［7］采用普通PCR技術(shù)對流腦疑似病例的腦脊液和血液標本中Nm種屬及各群的特異性DNA片段進行了檢測，發(fā)現(xiàn)6例流腦疑似患者的腦脊液標本中有5份Nm屬特異性基因CrgA陽性，5份檢出NmC群SiaD（C）基因片段；血液標本中1份檢出NmCrgA基因，1份檢出NmC群SiaD（C）基因片段。張文艷等［8］對Nm血紅素加氧酶的基因Hemo進行擴增，結(jié)果表明，Nm標準菌株為陽性結(jié)果，即擴增出長為424bp的DNA片段，而肺炎鏈球菌、乙型流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌均未擴增出該DNA片段，為陰性結(jié)果；PCR技術(shù)能檢測出4pg的腦膜炎雙球菌DNA，具有高敏感性；11份腦脊液樣品NmPCR檢測常規(guī)培養(yǎng)檢測結(jié)果顯示，PCR檢出率為36．3％，而培養(yǎng)法的檢出率為18．2％，PCR明顯高于培養(yǎng)法（P＜0．05）。徐麗等［9］則利用普通PCR技術(shù)建立了檢測29E群、X群和Z群等3個血清群Nm的方法，然后將該方法應(yīng)用于41份疑似Nm菌株標本的檢測，結(jié)果表明，41份疑似Nm標本中，29E群和X群PCR陽性的標本分別有7份和2份，未檢測出Z群菌株，建立了能準確、特異地鑒定29E群、X群和Z群Nm菌株的PCR方法。

3Nm的多重（復(fù)合）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

普通PCR主要用于單一致病因子的鑒定；多重PCR反應(yīng)原理與一般PCR相同，主要用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定，也可用于某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。近年來，多重PCR技術(shù)越來越廣泛應(yīng)用于Nm的檢測。任紅宇等［10］針對包括Nm在內(nèi)的8種細菌的特異性基因，通過優(yōu)化單一PCR擴增體系及擴增程序，初步建立了能同時檢測8種導(dǎo)致細菌性腦膜炎的病原體的復(fù)合PCR擴增方法。熊長輝等［11］應(yīng)用多重PCR技術(shù)對其實驗室保存的70株已經(jīng)血清學(xué)鑒定的Nm進行核酸鑒定及基因分群，同時檢測23例流腦疑似病例腦脊液標本中Nm特異性DNA片段，發(fā)現(xiàn)68株Nm的多重PCR檢測結(jié)果與血清學(xué)分群結(jié)果一致，2株血清學(xué)未能分群的Nm經(jīng)多重PCR檢測為C群；23例流腦疑似病例腦脊液標本經(jīng)多重PCR檢測有5例為C群，1例為A群，1例為B群，陽性檢出率為30．43％，傳統(tǒng)的病原分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)鑒定4例為C群，陽性檢出率為17．39％。可見多重PCR技術(shù)對Nm檢測的特異性優(yōu)于病原學(xué)檢測。DIAWARA等［12］應(yīng)用復(fù)合熒光實時PCR（RT－PCR）技術(shù)對腦脊液中的Nm和肺炎鏈球菌進行了檢測，結(jié)果表明，Nm和肺炎鏈球菌的不同熔融溫度的兩峰分別為87．5℃、85．5℃。Nm和肺炎鏈球菌的RT－PCR的靈敏度分別為100％（95％CI：82．4～100．0，85．1～100．0），二者特異度相同，均為100％（95％CI：88．6～100．0）。Nm和肺炎鏈球菌引起的腦膜炎的診斷準確率分別提高到50．7％和28．6％。DEFILIPPIS等［13］利用多重PCR技術(shù)對Nm、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌進行了檢測，總共收集了110個分離株和134例臨床標本（99例腦脊液和35例血液標本）并進行了分析，結(jié)果表明，所使用的方法快速、特異性好、靈敏度高。ZHU等［14］利用多重PCR技術(shù)對Nm進行了基因分型。結(jié)果表明，其檢測靈敏度為1ng基因組DNA（相當于4×105基因組），腦脊液標本中為3×105cfu／mL，這種多重PCR檢測可能有助于臨床診斷和流腦流行病學(xué)監(jiān)測。

4熒光定量PCR檢測Nm法

熒光定量PCR通過熒光染料或熒光標記的特異性探針對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，通過相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始水平。雷永良等［15］應(yīng)用該技術(shù)對167例流腦監(jiān)測標本進行了檢測，并與傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測進行比較，結(jié)果表明新方法與傳統(tǒng)方法陽性符合率為55．56％，另有4例傳統(tǒng)方法檢測為陰性的標本用熒光定量PCR檢測為陽性，其特異度、靈敏度都高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，且檢測周期更短。楊艷等［16］針對Nm特異性基因porA設(shè)計引物、探針，用實時熒光PCR技術(shù)進行檢測，并與常規(guī)PCR比較，結(jié)果表明應(yīng)用實時熒光PCR檢測時，64株Nm檢測結(jié)果均為陽性，6株非Nm結(jié)果均為陰性。檢測靈敏度達5．0×103cfu／mL，即5cfu／test，比常規(guī)PCR靈敏度高10倍，并且結(jié)果重復(fù)性好。張曉春等［17］采用熒光定量PCR檢測健康者咽拭子中Nm的帶菌情況，結(jié)果表明，熒光定量PCR的靈敏度、特異度均為100％，陽性預(yù)測值（PPV）為13．09％，陰性預(yù)測值（NPV）為100．00％，檢出限為0．5cfu／50μL體系，熒光定量PCR檢出結(jié)果的時間為3h，而培養(yǎng)法至少要2d。該方法可用于疾病的快速診斷，特別適合健康者的帶菌率調(diào)查。MIRONOV等［18］采用熒光定量PCR技術(shù)對Nm參考菌株和187例腦膜炎患者的腦脊液進行研究，結(jié)果表明該方法比傳統(tǒng)培養(yǎng)法有更好的特異性和敏感性。文獻［12］也將熒光定量PCR技術(shù)與多重PCR技術(shù)結(jié)合，取得了良好的實驗結(jié)果。

5酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測Nm抗體水平

應(yīng)用ELISA間接法檢測患者急性期和恢復(fù)期血清中的抗體水平，如恢復(fù)期效價較急性期呈4倍或4倍以上升高，可作為流腦的輔助鑒別。ELISA間接法也可以應(yīng)用于健康者血清抗體的測定，結(jié)果可為當?shù)氐牧髂X防控提供參考。張洪飛等［19］應(yīng)用ELISA分析了通遼市科左中旗221例健康者Nm帶菌情況及其抗體水平，檢出腦膜炎雙球菌13株，總帶菌率為3．81％；A群抗體陽性率為71．91％，C群抗體陽性率為47．51％，為該地區(qū)今后的流腦預(yù)防、控制提供了科學(xué)依據(jù)。

6Nm的分子分型及其他新技術(shù)

多位點序列分型（MLST）技術(shù)是從基因水平通過管家基因的點突變對Nm進行分型，利用MLST可以對數(shù)十年前不同地區(qū)分離的菌株之間的親緣關(guān)系進行評估，尤其是對不同菌群之間基因發(fā)生的頻繁的重組事件，分析菌株進化關(guān)系及判斷分離株是否屬高致病性克隆系等方面，可彌補傳統(tǒng)血清型分型方法的不足［20］。MLST適合用于長期的、大范圍的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測菌群結(jié)構(gòu)變化，研究地域性傳播和流行性變遷。兩株細菌MLST分型結(jié)果相同，表示這兩株細菌屬于相同的克隆或者克隆群，不能認為他們之間有流行病學(xué)聯(lián)系。朱水榮等［20］采用MLST技術(shù)，對浙江省2004－2013年部分Nm菌株開展基因分型研究，得出了浙江省Nm分離株間的遺傳進化關(guān)系，為今后有針對性地制訂流腦預(yù)防控制措施提供參考。鄧小玲等［21］則采用MLST技術(shù)，對廣東省Nm分離株間的遺傳進化關(guān)系進行了研究，為有針對性地采取預(yù)防控制措施提供依據(jù)。脈沖場凝膠電泳（PFGE）是一種分離大分子DNA的方法，實踐表明，大于40kb的DNA不能在恒強水平瓊脂糖凝膠電泳中分離，PFGE解決了這一難題。PFGE可以用來分離相對分子質(zhì)量10kb到10Mb的DNA分子。其分型的基礎(chǔ)是大片段的插入、缺失、重組或質(zhì)粒的獲得、丟失或酶切位點的點突變。MOODLEY等［22］應(yīng)用PFGE技術(shù)對南非2002－2006年B群Nm克隆分析，發(fā)現(xiàn)了一個新的基因克隆ST－4240／6688。邵祝軍等［23］則應(yīng)用PFGE技術(shù)對中國C群Nm分離株進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AH1是中國C群Nm主要的帶型。在流腦調(diào)查中，上述兩種分子分型的運用原則：暴發(fā)調(diào)查時所有菌株進行PFGE，挑選代表菌株進行MLST，對于流腦特異性引物PCR擴增陽性的患者血清或者腦脊液未能分離到菌株的進行MLST；個案調(diào)查時所有菌株進行PFGE和MLST分型，對于流腦特異性引物PCR擴增陽性的患者血清或者腦脊液未能分離到菌株的進行MLST；健康攜帶情況調(diào)查及在全國范圍的、長期的流行情況調(diào)查時所有菌株進行PFGE，挑選代表菌株進行MLST分型。多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（MLVA）也是一種分子分型技術(shù)，其分型依據(jù)為VNTR位點的滑鏈突變。該方法具有較好的分辨力、重復(fù)性、分型力及可比性，操作簡單，試驗周期為1d。SHAN等［24］應(yīng)用MLVA技術(shù)分析了序列型為ST－4821的C群Nm引起的2010年中國山東省的流腦疫情暴發(fā)。2000年日本學(xué)者發(fā)明了恒溫核酸擴增技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）。

近年來該技術(shù)已成功地應(yīng)用于流腦、SARS、禽流感、HIV等疾病的檢測中。LEE等［25］應(yīng)用LAMP技術(shù)對腦脊液中的Nm進行了快速鑒定，結(jié)果表明，該方法靈敏度高（比傳統(tǒng)的PCR方法高2～5個數(shù)量級），反應(yīng)時間短（30～60min就能完成反應(yīng)）。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是從蛋白質(zhì)水平進行生命科學(xué)研究的新方法。有疾控工作者用該方法初步探索了Nm部分蛋白表型特征分析。胡源等［26］利用雙向電泳技術(shù)與質(zhì)譜結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對66株C群Nm菌株及2株參考菌株的部分外膜蛋白和sucD蛋白表型進行分析，根據(jù)外膜蛋白和sucD蛋白將實驗菌株共分為9型，其中安徽菌株分型結(jié)果顯示出了高度的一致性，而其他地區(qū)菌株分型分布則顯示出高度的多態(tài)性，結(jié)果對認識安徽省流腦的流行規(guī)律和有效進行流腦疫情的防控具有重要意義。綜上所述，Nm的實驗室檢測技術(shù)涉及傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測技術(shù)、免疫學(xué)ELISA及不斷更新的分子生物學(xué)方法，如PCR、熒光定量PCR、多重PCR、LAMP技術(shù)、MLVA分型、MLST技術(shù)、PFGE分型、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等。Nm的分子生物學(xué)方法比傳統(tǒng)病原學(xué)檢測法具有更高的特異性和靈敏度。當然各種技術(shù)并非單一的，實際工作中可能相互融合，以更好地優(yōu)化Nm的檢測分析。新的方法也有其不足之處，如LAMP因靈敏度高，容易形成氣溶膠污染，由于國內(nèi)大多數(shù)實驗室不能嚴格分區(qū)，假陽性問題可能比較嚴重，因此，引物設(shè)計要求比較高，有些疾病的基因可能不適合使用LAMP；蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中2－DE技術(shù)還不成熟，現(xiàn)在有更新的色譜質(zhì)譜聯(lián)用法取代2－DE和質(zhì)譜鑒定法，對蛋白質(zhì)的鑒定更準確，將更好地服務(wù)于疾病預(yù)防控制工作中。

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作者：廖春艷綜述；李志峰；段剛；審校 單位：重慶市疾病預(yù)防控制中心