腸道菌群功能及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)程范文

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摘要:大量的微生物存在于動(dòng)物的胃腸內(nèi)，在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化與選擇之后，它們形成了一個(gè)動(dòng)態(tài)的微生物系統(tǒng)。腸道菌群與機(jī)體的相互作用對(duì)動(dòng)物本身來(lái)說(shuō)十分重要，近年來(lái)更是已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。腸道菌群的功能主要體現(xiàn)在它對(duì)機(jī)體的生物屏障作用、營(yíng)養(yǎng)作用、免疫作用等方面。腸道菌群的檢測(cè)方法是研究腸道菌群的重點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題，目前主要技術(shù)有分離培養(yǎng)、質(zhì)譜技術(shù)、宏基因組測(cè)序等。文章結(jié)合大量文獻(xiàn)資料，總結(jié)了目前腸道菌群功能的相關(guān)研究成果及研究方法。

關(guān)鍵詞:腸道菌群;菌群功能;檢測(cè)技術(shù);分離培養(yǎng);質(zhì)譜技術(shù);宏基因組測(cè)序

動(dòng)物腸道內(nèi)存在著大量的微生物，這些微生物在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化與選擇之后逐漸形成了一個(gè)動(dòng)態(tài)的微生物系統(tǒng)。文章從腸道菌群的生物屏障作用、營(yíng)養(yǎng)作用、免疫作用等方面介紹了腸道菌群功能，總結(jié)了目前研究中常用的腸道菌群檢測(cè)技術(shù)———分離培養(yǎng)、質(zhì)譜技術(shù)、宏基因組測(cè)序等，并對(duì)幾種檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行對(duì)比和分析，對(duì)未來(lái)可能的研究發(fā)展方向進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1腸道菌群介紹

腸道菌群，即腸道內(nèi)的正常微生物。人體的腸道菌群是一個(gè)由近1014個(gè)微生物復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)［1］。科學(xué)家對(duì)腸道微生物的研究可以追溯到1886年，當(dāng)時(shí)已經(jīng)有人發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌并指出其對(duì)消化的作用。后來(lái)又有學(xué)者提出了“梅氏假說(shuō)”，即酸奶中所富含的乳酸菌可以對(duì)腸道菌群產(chǎn)生作用，減少腐敗菌在腸道中的生長(zhǎng)。之后關(guān)于腸道菌群與機(jī)體關(guān)系的相關(guān)探索逐步加深，科學(xué)家們逐漸發(fā)現(xiàn)腸道菌群對(duì)于宿主的重大影響，并稱(chēng)其為“被忽略的人體器官”。動(dòng)物腸道內(nèi)存在著30屬500多種細(xì)菌，主要為厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌，數(shù)量最多的為類(lèi)桿菌、優(yōu)(真)桿菌、消化球菌及雙歧桿菌等專(zhuān)性厭氧菌，占99%以上，其中僅類(lèi)桿菌及雙歧桿菌就占細(xì)菌總數(shù)的90%以上。其余還有數(shù)量較少的大腸桿菌、腸球菌、乳桿菌及韋榮小球菌，數(shù)量最少的葡萄球菌、魏氏梭菌、變形桿菌等。已有相關(guān)研究證實(shí)，腸道菌群既有“共性”，也有“個(gè)性”［2］，這主要體現(xiàn)在不同宿主體內(nèi)的微生物菌群組成情況上。不同個(gè)體相比，腸道菌群的主要組成類(lèi)群非常相近，并都可分為擬桿菌型、普氏菌型及瘤胃球菌型，但微生物菌群的相對(duì)含量和菌株種類(lèi)在不同個(gè)體間的差異卻十分顯著，其影響因素主要為生存環(huán)境［3］、年齡［4］、生理狀況［5－6］等，除此之外飲食也是造成以上區(qū)別的一個(gè)重要原因，并且相對(duì)容易改變和控制。在各種因素影響著腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的同時(shí)，腸道菌群也在對(duì)宿主的各個(gè)方面產(chǎn)生不同程度的作用與影響。目前，腸道菌群已經(jīng)成為科學(xué)家們研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)問(wèn)題，并且已經(jīng)有許多相關(guān)研究取得了進(jìn)展。

2腸道菌群的功能

2.1生物屏障作用

腸道菌群的生物屏障作用即指頡頏外來(lái)致病菌的作用。早在1887年就已經(jīng)有科學(xué)家觀察到微生物之間具有頡頏作用，并利用這種頡頏作用成功預(yù)防和治療了家兔的炭疽病。1973年有人提出腸道菌群的減少可導(dǎo)致仔雞容易被致病性沙門(mén)氏桿菌感染。隨著科學(xué)家對(duì)腸道菌群的深入研究，證實(shí)了腸道菌群具有保護(hù)機(jī)體、抵御外來(lái)致病菌的作用。腸道菌群的這種功能又被人為地劃分成生物屏障和化學(xué)屏障。生物屏障即指腸道正常菌群定殖于腸道中，以此對(duì)外來(lái)致病菌的定殖占位造成影響，使其無(wú)法在宿主體內(nèi)定居生長(zhǎng)和繁殖。而化學(xué)屏障是指腸道菌群代謝產(chǎn)物(如乙酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素等)對(duì)外來(lái)致病菌能夠產(chǎn)生致命作用或者可以減少其在腸道內(nèi)的定殖。

2.2營(yíng)養(yǎng)作用

腸道菌群的營(yíng)養(yǎng)作用體現(xiàn)在多個(gè)方面。首先，其可消耗致病菌生長(zhǎng)所需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制外來(lái)致病菌的生長(zhǎng)繁殖，并利用宿主體內(nèi)不存在的酶彌補(bǔ)宿主在消化酶上的缺陷［7］。這種行為加強(qiáng)了宿主機(jī)體對(duì)外來(lái)致病菌的抵御作用，并使得宿主對(duì)于各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用能力更強(qiáng)。其次，腸道的正常微生物(如雙歧桿菌、乳酸桿菌等)能合成多種人體生長(zhǎng)發(fā)育所必需的維生素，如B族維生素(維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12)、維生素K、煙酸、泛酸等，還能利用蛋白質(zhì)殘?jiān)铣杀匦璋被幔缣於T(mén)氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和蘇氨酸等，并參與糖類(lèi)和蛋白質(zhì)的代謝，同時(shí)還能促進(jìn)鐵、鎂、鋅等礦物元素的吸收，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)于宿主的機(jī)體來(lái)說(shuō)是必需的，它們的缺乏會(huì)導(dǎo)致機(jī)體功能失常。細(xì)菌還可以通過(guò)氧化、還原、水解等反應(yīng)使氨基酸脫氨產(chǎn)生氨、二氧化碳，以及乙酸、丙酸、丁酸、丙酮酸、琥珀酸等有機(jī)酸。

2.3免疫作用

腸道是動(dòng)物與外界環(huán)境接觸最多的器官之一，也是機(jī)體最大的免疫器官。腸黏膜中分布著超過(guò)全身半數(shù)的淋巴組織。腸道中定殖了大量的微生物。腸黏膜屏障包括機(jī)械屏障、免疫屏障與生物屏障。腸道正常菌群對(duì)腸黏膜免疫屏障功能的調(diào)控扮演著雙重角色。一方面，腸道菌群作為抗原對(duì)腸黏膜存在潛在的危害;另一方面，腸內(nèi)寄生菌可為腸黏膜細(xì)胞提供某些營(yíng)養(yǎng)成分，維持腸道菌群平衡，激活腸道免疫系統(tǒng)［8］。除此之外，動(dòng)物腸道菌群作為抗原物質(zhì)還能促進(jìn)宿主的免疫器官發(fā)育，增加T、B淋巴細(xì)胞的數(shù)量，產(chǎn)生非特異性免疫作用;通過(guò)對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的持續(xù)刺激，使其產(chǎn)生免疫反應(yīng)來(lái)增加機(jī)體的免疫能力［9］。例如雙歧桿菌，它是動(dòng)物腸道內(nèi)數(shù)量最多的有益菌，含有腸道寄生菌共同抗原，可以影響?zhàn)つっ庖叩闹饕в靡蜃臃置谛郧虻鞍祝趯?duì)機(jī)體的特異性與非特異性免疫上影響巨大［10］。已經(jīng)有相關(guān)研究證明減少接觸微生物的機(jī)會(huì)，會(huì)導(dǎo)致慢性炎性疾病的增多，并指出這可能是導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)缺陷的一個(gè)重要原因。菌群失調(diào)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫紊亂和屏障功能減弱，這也是證明腸道菌群與機(jī)體免疫之間關(guān)系緊密的一個(gè)方面［11］。在實(shí)踐和生產(chǎn)中，腸道菌群已經(jīng)有和疫苗混合使用來(lái)提高抗體水平和作為具有免疫活性的佐劑的應(yīng)用。如在新城疫疫苗接種前后給雞喂食益生素，可以提高雞血清中抗新城疫病毒血凝抑制抗體的含量并延長(zhǎng)抗體的高峰期。光合細(xì)菌與H52混合使用，可以提高雞體內(nèi)的γ－球蛋白和雞傳染性支氣管炎病毒抗體水平。有關(guān)研究指出雙歧桿菌具有免疫佐劑活性。目前，乳酸桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌已經(jīng)被制成活菌制劑，已有多種制劑被廣泛應(yīng)用于微生物飼料添加劑和治療劑中，用來(lái)防治動(dòng)物腸道疾病。

2.4其他作用

腸道菌群對(duì)機(jī)體除了具有屏障作用、營(yíng)養(yǎng)作用和免疫作用之外，還能對(duì)機(jī)體的造血功能產(chǎn)生直接或者間接的影響。有學(xué)者使小鼠腸道微生物消失導(dǎo)致其骨髓和外周血中粒細(xì)胞生成減少，從而證明了這一觀點(diǎn)。腸道正常菌群可以產(chǎn)生超氧化物歧化酶，使宿主體內(nèi)的自由基歧化反應(yīng)加速，有一定的抗衰老作用。腸道菌群還能產(chǎn)生多種酶，對(duì)腫瘤的產(chǎn)生有抑制作用［12］。腸道菌群對(duì)情緒也有影響，還可通過(guò)腸－腦軸影響宿主的行為［13］。

3腸道菌群檢測(cè)技術(shù)

3.1分離培養(yǎng)

分離培養(yǎng)是最早在試驗(yàn)中使用的一種方法，目前已經(jīng)相對(duì)比較成熟，應(yīng)用于許多研究領(lǐng)域。該方法主要是利用選擇性培養(yǎng)基把各種細(xì)菌分離開(kāi)，并根據(jù)染色、生化反應(yīng)、血清學(xué)試驗(yàn)等方法對(duì)分離出的細(xì)菌進(jìn)行鑒別，這種方法還可以用來(lái)測(cè)定活菌的數(shù)量。例如，徐鳳等［14］對(duì)2月齡斷奶羔羊、8月齡和2歲山羊瘤胃和回腸刮取物中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定;白娜［15］利用純培養(yǎng)技術(shù)與16SrDNA技術(shù)結(jié)合對(duì)采集自?xún)?nèi)蒙古錫林郭勒牧區(qū)的36份健康家畜糞便樣品中的微生物進(jìn)行了分離鑒定;聶遠(yuǎn)洋等［16］利用不同培養(yǎng)基研究了不同年齡麥洼牦牛腸道菌群與其群落結(jié)構(gòu)的變化。這種利用不同培養(yǎng)基分離培養(yǎng)細(xì)菌的方法雖然已經(jīng)比較成熟，能顯示出不同細(xì)菌對(duì)宿主腸道系統(tǒng)中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用情況，但也有一定的缺點(diǎn)，如該方法不僅耗時(shí)長(zhǎng)而且進(jìn)行研究的微生物種類(lèi)具有很大的局限性，自然界中有90%～99%的微生物無(wú)法通過(guò)分離培養(yǎng)的方法進(jìn)行分析，顯然可分析的這一小部分微生物對(duì)研究腸道菌群這個(gè)整體和腸道微生物系統(tǒng)與宿主的關(guān)系來(lái)說(shuō)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。

3.2質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)是利用腸道菌群中不同菌種的組成蛋白種類(lèi)不同這一特性來(lái)對(duì)蛋白質(zhì)的種類(lèi)進(jìn)行鑒定，從而得出其組成細(xì)菌的功能和特性的。基質(zhì)輔助激光解析電離時(shí)間飛行質(zhì)譜(MALDI－TOF)的出現(xiàn)，成為從蛋白質(zhì)水平對(duì)腸道菌群進(jìn)行研究的有效工具。質(zhì)譜技術(shù)的原理是利用激光輻射微生物樣品與等量基質(zhì)溶液揮發(fā)后形成的晶體，基質(zhì)吸收能量解析而樣品分子電離，對(duì)形成的離子峰與離子質(zhì)荷比的指紋圖譜進(jìn)行分析比較，然后再進(jìn)行比對(duì)區(qū)分出腸道菌群的種類(lèi)。該方法在研究不同腸道菌群的種類(lèi)時(shí)快速而準(zhǔn)確，可以區(qū)分不同菌群與不同狀態(tài)下的蛋白質(zhì)圖譜。但這種方法對(duì)樣品的采集和處理要求較高，且質(zhì)譜技術(shù)的分析方法目前并不成熟，還需進(jìn)一步優(yōu)化。

3.3宏基因組測(cè)序

1998年宏基因組的概念被提出，當(dāng)時(shí)人們對(duì)它的定義是環(huán)境中所有微生物的遺傳信息，目前主要是指環(huán)境中細(xì)菌和真菌基因組的和［17］。宏基因組測(cè)序技術(shù)又分為16SrDNA技術(shù)和全基因組測(cè)序技術(shù)。16SrDNA技術(shù)是目前腸道菌群系統(tǒng)分類(lèi)研究中最常用的一種方法，相較于5S和23SrDNA，16SrDNA大小適中，既容易獲取又能明顯比較出不同菌群的區(qū)別。16SrDNA技術(shù)的原理是通過(guò)直接獲取腸道菌群的DNA信息，與基因庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，經(jīng)過(guò)分析后可以對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)。目前所有已知細(xì)菌的16SrDNA堿基序列都已經(jīng)可以在基因庫(kù)中找到，這也為16SrDNA測(cè)定法在試驗(yàn)研究中的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。王純等［18］用該方法對(duì)草魚(yú)與團(tuán)頭魴的腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析，提出了草魚(yú)和團(tuán)頭魴消化道內(nèi)微生物群落營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝方式類(lèi)似的觀點(diǎn)。這種技術(shù)解決了傳統(tǒng)的微生物鑒定方法難以鑒定眾多的生長(zhǎng)習(xí)性復(fù)雜的微生物的問(wèn)題，目前已經(jīng)在許多研究中被使用。但是16SrDNA技術(shù)的費(fèi)用較高、耗時(shí)長(zhǎng)且不能進(jìn)行定量分析，而且該技術(shù)依賴(lài)于PCR技術(shù)，在PCR中存在的樣品容易污染的問(wèn)題也會(huì)影響16SrDNA的分析結(jié)果，所以仍需對(duì)腸道菌群豐度和數(shù)量準(zhǔn)確變化的測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化。全基因組測(cè)序即對(duì)樣品核酸進(jìn)行提取，測(cè)定其序列并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。測(cè)定過(guò)程中省略了擴(kuò)增程序，直接獲取核酸信息，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息進(jìn)行比對(duì)，經(jīng)過(guò)分析后得出致病菌的種類(lèi)，用于檢測(cè)樣品中毒性菌株的耐藥性，進(jìn)行相關(guān)毒理學(xué)研究。高菽蔓等［19］利用全基因組測(cè)序研究了犬副流感病毒CC－14株全基因組序列特征。這種方法解決了傳統(tǒng)研究方法需要菌群分離的過(guò)程，更快速、便捷，也解決了有些菌種難以用傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的問(wèn)題。與16SrDNA技術(shù)相比不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，避免了擴(kuò)增過(guò)程中樣品被污染的可能，結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。目前，這種方法被廣泛應(yīng)用于腸道菌群和環(huán)境菌群的研究之中，對(duì)于菌群的毒力作用與生活史的研究具有重要意義。

3.4其他技術(shù)

分子標(biāo)記法的靈敏性和特異性較高，常見(jiàn)的具體方法有熒光原位雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)等。熒光原位雜交技術(shù)可以研究腸道細(xì)菌和其余組織之間的關(guān)系，并且可以保持腸道菌群與腸道組織的原本情況。基因芯片技術(shù)即DNA微陣列，具有在處理多個(gè)基因時(shí)高效快速的特點(diǎn)。DNA指紋圖譜分析法依賴(lài)于分析對(duì)象的分子大小與核酸序列的不同，其中的變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)目前已經(jīng)可以分辨出只有一個(gè)堿基差異的基因序列，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)研究方法精度不高的缺點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于微生物多樣性和種群差異的研究中。這些對(duì)腸道菌群的研究方法在使用時(shí)并不是唯一的，在實(shí)際的研究中，有時(shí)可能會(huì)兩種甚至多種方法并用進(jìn)行鑒定研究。

4小結(jié)

人們已經(jīng)意識(shí)到了腸道微生物對(duì)于宿主機(jī)體的重要性，不論是腸道菌群帶給機(jī)體抵御外來(lái)致病因素的屏障作用，對(duì)于機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)作用、免疫作用，還是其他作用，對(duì)于宿主來(lái)說(shuō)都是不能忽視的。失去了腸道正常菌群的作用，機(jī)體會(huì)受到嚴(yán)重的損傷與一些功能的喪失。現(xiàn)在已經(jīng)有許多的科學(xué)家投入到了腸道菌群的研究中，為揭示腸道菌群與宿主之間的關(guān)系和影響作出了巨大的貢獻(xiàn)。但是這些研究成果對(duì)于腸道菌群與機(jī)體相互作用的整體來(lái)說(shuō)仍然只是其中的一小部分，仍然還有許多的內(nèi)容等待學(xué)者們?nèi)パ芯俊＠纾c道菌群對(duì)宿主機(jī)體作用的機(jī)制目前尚未完全研究清楚，腸道菌群是如何對(duì)宿主的健康甚至情緒產(chǎn)生影響的也尚無(wú)定論。相較于傳統(tǒng)的腸道菌群研究方法，目前的技術(shù)手段已經(jīng)取得了非常大的進(jìn)步。但是這些技術(shù)仍然存在缺陷，對(duì)于研究腸道菌群來(lái)說(shuō)仍顯不足，還需進(jìn)一步優(yōu)化，如對(duì)于樣品的處理方式應(yīng)有所突破，對(duì)于腸道菌群的信息處理仍需優(yōu)化。在未來(lái)，期待有更簡(jiǎn)便快捷的方法出現(xiàn)，并結(jié)合目前已有的研究方法，按照需求進(jìn)行選取以更有效地達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康模柚锎髷?shù)據(jù)的方法可能會(huì)是未來(lái)研究的發(fā)展方向。

作者：黃皓，郝麗；肖向紅；張晶鈺；柴龍會(huì)；劉暢單位：東北林業(yè)大學(xué)