大鼠骨骼肌雙重神經(jīng)支配收縮力及肌纖維類型變化范文

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作者：劉浩，史松，白曉斌，曹永孝

【摘要】目的:評(píng)價(jià)神經(jīng)壓榨保留血運(yùn)股薄肌轉(zhuǎn)移肛門(mén)外括約肌成形術(shù)，用于直腸癌Miles術(shù)后肛門(mén)重建的臨床應(yīng)用前景.方法:將48只SD大鼠隨機(jī)分為腓骨長(zhǎng)肌雙重神經(jīng)支配組、暫時(shí)去神經(jīng)支配組、去神經(jīng)支配組及對(duì)照組，各行進(jìn)行相應(yīng)的手術(shù)操作，于術(shù)后5mo測(cè)量肌肉收縮力，取肌肉標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)檢查.結(jié)果:腓骨長(zhǎng)肌雙重神經(jīng)支配組腓骨長(zhǎng)肌的I型肌纖維所占比例明顯增加，單收縮最大收縮時(shí)間及最大舒張時(shí)間、強(qiáng)直收縮的最大收縮時(shí)間明顯延長(zhǎng).結(jié)論:通過(guò)接受慢肌和自身神經(jīng)支配的雙重神經(jīng)支配，骨骼肌肌纖維構(gòu)成可以發(fā)生改變，抗疲勞性改善，可替代肛門(mén)外括約肌的功能.

【關(guān)鍵詞】肌，骨骼；雙重神經(jīng)支配；肌纖維；抗疲勞性；肛門(mén)外括約肌成形術(shù)

0引言

動(dòng)態(tài)股薄肌轉(zhuǎn)移肛門(mén)成形術(shù)是直腸癌Miles術(shù)后肛門(mén)重建研究的熱點(diǎn)［1］，但國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有神經(jīng)壓榨保留血運(yùn)股薄肌轉(zhuǎn)移肛門(mén)外括約肌成形術(shù)用于直腸癌Miles術(shù)后肛門(mén)重建的研究.我們通過(guò)對(duì)大鼠骨骼肌兼受快肌和慢肌的雙重神經(jīng)支配后，肌肉收縮力及肌纖維類型變化研究，為神經(jīng)壓榨保留血運(yùn)股薄肌轉(zhuǎn)移肛門(mén)外括約肌成形術(shù)用于直腸癌Miles術(shù)后肛門(mén)重建提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并評(píng)價(jià)其在臨床上的應(yīng)用前景.

1材料和方法

1.1材料健康成年SD大鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量200～250g（西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；BioLab420型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)分析系統(tǒng)及張力換能器(JHz204008型,50g)均為成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品；ATP酶（80mg×1支）購(gòu)于Sigma公司.其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組將大鼠隨機(jī)分為4組，每組12只.①腓骨長(zhǎng)肌雙重神經(jīng)支配(PDIN)組：用100g/L水合氯醛按300mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉.第1次手術(shù)：大鼠俯臥位，固定四肢，常規(guī)消毒、鋪無(wú)菌巾，取右下肢腘窩處縱切口，暴露比目魚(yú)肌(SOL)、腓骨長(zhǎng)肌及其支配的神經(jīng).在神經(jīng)進(jìn)入腓骨長(zhǎng)肌上方約3mm處，向近端以2mm間隔，分別以金屬鉗（蚊式鉗）壓榨三處，壓榨強(qiáng)度為夾至血管鉗滿扣約5s，夾傷（針麻儀刺激無(wú)反應(yīng)）神經(jīng)上方以細(xì)絲線標(biāo)記.仔細(xì)剝除SOL與腓骨長(zhǎng)肌間的肌外膜.切斷SOL止點(diǎn)，將SOL遠(yuǎn)端向腓骨長(zhǎng)肌方向靠攏，兩肌肉遠(yuǎn)端成向腓骨長(zhǎng)肌方向靠攏成銳角，兩肌肉接觸面約0.5cm×1cm,分別以細(xì)絲線間斷縫合肌肉接觸面的前、后緣肌外膜.術(shù)中保護(hù)肌肉的血液供應(yīng).第2次手術(shù)：5mo后，麻醉方法同前，原切口暴露腓骨長(zhǎng)肌，行肌肉收縮力測(cè)定，測(cè)定完畢后切取腓骨長(zhǎng)肌后將大鼠處死.②腓骨長(zhǎng)肌暫時(shí)去神經(jīng)支配(PTDN)組：操作同①，但不切斷SOL止點(diǎn)，不剝除肌膜，不將兩肌肉縫合.③腓骨長(zhǎng)肌去神經(jīng)支配(PDN)組：操作同①，但將腓骨長(zhǎng)肌的支配神經(jīng)完全切斷.④對(duì)照組：切開(kāi)皮膚后，觀察肌肉的血供及神經(jīng)支配，然后縫合皮膚.

1.2.2一般觀察麻醉方法同前，俯臥位，原切口暴露腓骨長(zhǎng)肌神經(jīng)夾傷近端、SOL神經(jīng)、腓骨長(zhǎng)肌.觀察肌肉的萎縮程度；用針麻儀分別刺激腓骨長(zhǎng)肌神經(jīng)夾傷近端和SOL神經(jīng)，觀察腓骨長(zhǎng)肌的收縮情況.

1.2.3肌肉收縮力的測(cè)定參考文獻(xiàn)［2］并加以改進(jìn)，制作大鼠右后肢坐骨神經(jīng)-腓骨長(zhǎng)肌標(biāo)本，選用1根長(zhǎng)約10cm的細(xì)線縛于腓骨長(zhǎng)肌肌腱上,將縛線另一端連接于張力換能器懸梁臂上,再將換能器固定于支架上,使肌肉處于最適初長(zhǎng)度,用保護(hù)刺激電極給坐骨神經(jīng)干進(jìn)行刺激,描記波形,并記錄數(shù)據(jù).實(shí)驗(yàn)中為防止神經(jīng)肌肉干燥,表面持續(xù)滴注生理鹽水,并注意保溫,動(dòng)物直腸溫度維持在37℃左右.在單刺激(波寬為0.2ms)條件下,找到最大刺激強(qiáng)度,并觀察肌肉單收縮的收縮幅度、最大收縮時(shí)間及最大舒張時(shí)間,計(jì)算引起完全性強(qiáng)直收縮的最小刺激頻率(1000/最大收縮時(shí)間)；分別在連續(xù)單刺激(波寬為0.2ms)2倍及5倍最大刺激強(qiáng)度引起完全性強(qiáng)直收縮的最小刺激頻率條件下,觀察完全性強(qiáng)直收縮的收縮幅度及最大收縮時(shí)間.

1.2.4組織病理學(xué)檢查快速切取腓骨長(zhǎng)肌，用濾紙吸干，肉眼觀察肌肉的萎縮程度，液氮冷凍，恒溫冰凍切片，片厚為10μm，行肌球蛋白ATP酶染色(pH9.4)［3］：ATP酶孵育液20mL臨時(shí)配制:0.1mol/LNaOH7mL,1mol/LCaCl22mL,0.1mol/L甘氨酸NaCl10mL,ATP酶注射液1mL.37℃溫箱內(nèi)1.5h.10g/LCaCl26min,20g/LCoCl26min,水洗5min,經(jīng)硫化銨稀釋液30s,水洗5min,最后脫水、透明、封固.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示,采用兩組比較的t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性.

2結(jié)果

2.1一般狀況PDIN，PTDN和PDN組分別有4，2，3只大鼠實(shí)驗(yàn)失敗，其中有2只大鼠死于其他疾病；5只大鼠肌肉縫合部位形成明顯瘢痕組織，針麻儀刺激SOL神經(jīng)，肌肉無(wú)收縮反應(yīng)；2只大鼠肌肉縫合部位裂開(kāi).與對(duì)照組比較，其他3組的腓骨長(zhǎng)肌均有不同程度的萎縮，但PDIN，PTDN組的萎縮程度明顯較PDN組輕；PDIN組與PTDN組相比，萎縮程度無(wú)明顯差異.針麻儀以與第1次手術(shù)相同的強(qiáng)度,分別刺激第1次手術(shù)處理過(guò)的腓骨長(zhǎng)肌神經(jīng)上方及SOL神經(jīng)，PDIN組可引起腓骨長(zhǎng)肌明顯收縮；PTDN組刺激腓骨長(zhǎng)肌神經(jīng)可引起腓骨長(zhǎng)肌明顯收縮，刺激SOL神經(jīng)未見(jiàn)腓骨長(zhǎng)肌收縮；PDN組刺激腓骨長(zhǎng)肌神經(jīng)不引起腓骨長(zhǎng)肌收縮，刺激SOL神經(jīng)可見(jiàn)腓骨長(zhǎng)肌收縮；對(duì)照組刺激腓骨長(zhǎng)肌神經(jīng)可以引起腓骨長(zhǎng)肌收縮，刺激SOL神經(jīng)不引起腓骨長(zhǎng)肌收縮.

2.2腓骨長(zhǎng)肌的收縮力PDIN組的腓骨長(zhǎng)肌單收縮最大收縮時(shí)間及最大舒張時(shí)間、強(qiáng)直收縮的最大收縮時(shí)間明顯延長(zhǎng)（表1），與PTDN組及對(duì)照組比較有明顯差異(P&l

t;0.05),但與PDN組無(wú)顯著性差異；PTDN組的腓骨長(zhǎng)肌單收縮最大收縮時(shí)間及最大舒張時(shí)間、強(qiáng)直收縮的最大收縮時(shí)間較PDN組為短（P<0.05），與對(duì)照組相比無(wú)差異顯著性；PDN組腓骨長(zhǎng)肌單收縮最大收縮時(shí)間及最大舒張時(shí)間、強(qiáng)直收縮的最大收縮時(shí)間較對(duì)照組延長(zhǎng)（P<0.05).PDIN的腓骨長(zhǎng)肌單收縮、強(qiáng)直收縮的收縮幅度較PTDN組及PDN組高（P<0.05，P<0.01），較對(duì)照組低（P<0.05）；PTDN組的腓骨長(zhǎng)肌單收縮、強(qiáng)直收縮的收縮幅度較PDN組高（P<0.05）；PDN組的腓骨長(zhǎng)肌單收縮、強(qiáng)直收縮的收縮幅度較對(duì)照組低（P<0.01）.表1大鼠腓骨長(zhǎng)肌收縮性的變化(x±s)

2.3腓骨長(zhǎng)肌的組織病理學(xué)檢查與對(duì)照組比較，PDIN組腓骨長(zhǎng)肌I型肌纖維所占比例增加，II型肌纖維所占比例減少（圖1）；PTDN組腓骨長(zhǎng)肌肌纖維比例無(wú)明顯變化；PLDN組腓骨長(zhǎng)肌I型肌纖維所占比例增加，II型肌纖維所占比例減少.PDIN組腓骨長(zhǎng)肌I／II型肌纖維比例較PTDN組和對(duì)照組增高（P<0.01，表2）；與PDN組比較無(wú)差異顯著性.PDN組腓骨長(zhǎng)肌I／II型肌纖維比例較PTDN組和對(duì)照組增高（P<0.01）.PTDN組腓骨長(zhǎng)肌I／II型肌纖維比例較對(duì)照組無(wú)差異顯著性.表2大鼠腓骨長(zhǎng)肌肌纖維類型的變化(%,x±s)

3討論

Miles術(shù)仍為當(dāng)今公認(rèn)的低位直腸癌根治的“金標(biāo)準(zhǔn)”.然而，Miles術(shù)可能給患者的精神和心理造成巨大傷害及極度的生活不適，有的患者甚至因此而拒絕手術(shù)［4］.目前已有多種肌肉移植重建肛門(mén)外括約肌以恢復(fù)或改善肛門(mén)控制排便的能力［5-6］，國(guó)內(nèi)已將神經(jīng)壓榨保留血運(yùn)股薄肌轉(zhuǎn)移肛門(mén)外括約肌成形術(shù)用于治療小兒肛門(mén)失禁［7］，但國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有直腸癌Miles術(shù)后肛門(mén)重建的臨床應(yīng)用報(bào)道［8-9］.股薄肌和肛門(mén)外括約肌都是橫紋肌，但股薄肌的肌纖維構(gòu)成主要以II型肌纖維為主，持續(xù)收縮及耐疲勞的能力較差，而來(lái)自肛門(mén)外括約肌的神經(jīng)供應(yīng)可以使股薄肌的酶和代謝發(fā)生改變，具有耐疲勞和持續(xù)收縮的能力：而經(jīng)過(guò)神經(jīng)壓榨的去肌膜股薄肌一方面可以達(dá)到暫時(shí)去神經(jīng)支配的狀態(tài)，接受外來(lái)神經(jīng)的再生和支配，建立雙重神經(jīng)支配；另一方面可以減輕失去神經(jīng)的股薄肌的萎縮和纖維化［5-7］.此外，移植的肌肉可以和平滑肌直接接觸，肌電活動(dòng)相互影響，從而使移植的股薄肌更容易達(dá)到較好的肛門(mén)外括約肌功能.

哺乳類動(dòng)物的骨骼肌按照生化和生理標(biāo)準(zhǔn)分為快收縮易疲勞的II型肌纖維和慢收縮不易疲勞的I型肌纖維.正常情況下，骨骼肌只接受自身神經(jīng)的支配，但在特定條件下可以接受外來(lái)神經(jīng)的支配［10］.我們通過(guò)神經(jīng)壓榨或神經(jīng)離斷使以II型肌纖維為主的腓骨長(zhǎng)肌接受以I型肌纖維為主的SOL神經(jīng)支配，結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)壓榨后的腓骨長(zhǎng)肌可以獲得來(lái)自SOL神經(jīng)的支配，而且自身被壓榨的神經(jīng)干亦可通過(guò)再生重新支配腓骨長(zhǎng)肌.獲得雙重神經(jīng)支配的腓骨長(zhǎng)肌I型肌纖維所占構(gòu)成比例明顯增加，且明顯延長(zhǎng)單收縮最大收縮時(shí)間及最大舒張時(shí)間、強(qiáng)直收縮的最大收縮時(shí)間，增加了肌肉的抗疲勞能力，而原來(lái)壓榨神經(jīng)的重新支配可以降低肌肉的萎縮程度，增加肌肉收縮力.通過(guò)完全離斷自身神經(jīng)獲得SOL神經(jīng)支配的腓骨長(zhǎng)肌，雖然也可以實(shí)現(xiàn)幾乎相同程度的I型肌纖維所占構(gòu)成比例增加及抗疲勞的能力提高，但由于失去了原有神經(jīng)支配，肌萎縮程度較明顯，收縮力明顯降低.而單純壓榨自身支配神經(jīng)的腓骨長(zhǎng)肌，雖然可以通過(guò)神經(jīng)再生重新獲得原神經(jīng)的支配，但肌纖維構(gòu)成比例和抗疲勞的能力并無(wú)明顯的改善.所以，通過(guò)神經(jīng)壓榨實(shí)現(xiàn)雙重神經(jīng)支配的腓骨長(zhǎng)肌的效果最為理想.

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，獲得雙重神經(jīng)支配的腓骨長(zhǎng)肌的I型肌纖維類型的轉(zhuǎn)化程度，從僅有25%上升至約42%，但收縮幅度與對(duì)照組相比反而降低，這與預(yù)期效果有一定的差距.實(shí)驗(yàn)中為了防止肌肉過(guò)分牽拉損傷腓骨長(zhǎng)肌的血管致肌肉壞死，腓骨長(zhǎng)肌與SOL的接觸面積僅為0.5cm×1cm，接觸面積不充分可能為主要原因.本實(shí)驗(yàn)的肌纖維類型的轉(zhuǎn)化率雖較低，但從肌肉的收縮力檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)型后的腓骨長(zhǎng)肌收縮性確實(shí)發(fā)生了改變.

腓骨長(zhǎng)肌獲得以I型肌纖維為主的SOL神經(jīng)支配及自身神經(jīng)重新支配后，表現(xiàn)出的肌纖維類型轉(zhuǎn)型及耐疲勞能力增加的趨勢(shì)，提示神經(jīng)壓榨保留血運(yùn)股薄肌轉(zhuǎn)移肛門(mén)外括約肌成形術(shù)后，股薄肌也可以實(shí)現(xiàn)肌纖維類型的轉(zhuǎn)型、耐疲勞能力的增加.而且通過(guò)增加肌肉的接觸面積、改善手術(shù)技巧，效果會(huì)更明顯.實(shí)驗(yàn)證明神經(jīng)壓榨保留血運(yùn)股薄肌轉(zhuǎn)移肛門(mén)外括約肌成形術(shù)，在臨床上應(yīng)用于治療直腸癌Miles術(shù)后肛門(mén)重建是可行的.

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