MCAO模型大鼠中醫(yī)研究范文

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《中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志》2014年第六期

1材料與方法

1.1大鼠一般情況監(jiān)測①體質(zhì)量:體質(zhì)量變化分別在手術(shù)前、術(shù)后24h、48h、72h進(jìn)行體質(zhì)量稱量、記錄;②模型動(dòng)物精神、活動(dòng)情況、皮毛、尾色、大便等。

1.2神經(jīng)功能Zea-Longa評分分別在術(shù)后3h、6h、24h、48h、72h進(jìn)行神經(jīng)功能Zea-Longa評分，評分由兩位實(shí)驗(yàn)人員共同觀察記錄，每只大鼠僅做1次神經(jīng)功能Zea-Longa評分，實(shí)驗(yàn)要求在單盲的條件下進(jìn)行。

1.3放免法檢測血清CORT實(shí)驗(yàn)?zāi)笫蠼?jīng)麻醉后由腹主動(dòng)脈取血3ml加入空白試管中，4℃3000r/min離心15min，取上清置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆茫琶夥z測血清CORT含量，由北京康源瑞德生物科技有限公司嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行檢測。

1.4腦組織形態(tài)學(xué)觀察大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后夾閉腹主動(dòng)脈，剪開胸部將灌注針由左心室穿入主動(dòng)脈，依次注入0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛。灌注30min后，取出腦固定于4%多聚甲醛中24h，石蠟包埋。經(jīng)HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腦組織織形態(tài)學(xué)改變。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x珋±s)表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較用最小顯著差法(leastsignificantdifference，LSD)。如方差不齊或不符合正態(tài)分布，用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠一般狀況一般大鼠在手術(shù)完成后1.5～2h蘇醒，手術(shù)完成3h后開始進(jìn)行評分，可見大鼠偏癱癥狀明顯，表現(xiàn)為右側(cè)肢體廢用或力弱、前肢力弱、后肢拖拽，行走呈順鐘向追尾狀，甚則向一側(cè)傾倒;此外還可觀察到，48h、72h手術(shù)組的大鼠在造模后24h均出現(xiàn)左側(cè)瞼裂變小、左眼球腫脹并伴有分泌物，活動(dòng)減少，身體蜷縮，體質(zhì)量明顯下降及肛周污染、稀便、舌質(zhì)紫暗等癥狀，各時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組動(dòng)物均未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀。

2.2各組大鼠體質(zhì)量變化表1顯示，與假手術(shù)組比較，術(shù)后24h、48h、72h各時(shí)間點(diǎn)手術(shù)組大鼠體質(zhì)量均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。

2.3各組大鼠神經(jīng)功能Zea-Longa評分變化表2顯示，與假手術(shù)組比較，各時(shí)間點(diǎn)手術(shù)組大鼠Zea-Longa神經(jīng)功能評分均明顯增高(P＜0.01)。

2.4各組大鼠血清CORT水平變化表3顯示，與正常組比較，假手術(shù)6h、48h、72h組血清CORT有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);手術(shù)6h、48h、72h組血清CORT明顯升高，與48h、72h組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與假手術(shù)組比較，手術(shù)48h、72h組血清CORT明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。與手術(shù)6h組比較，手術(shù)72h組血清CORT明顯升高(P＜0.01)。

2.5各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)觀察正常組、假手術(shù)6h、48h組及假手術(shù)72h組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完整，排列緊密，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，胞漿呈粉紅色，胞核完整，核仁清晰，細(xì)胞周圍間隙無水腫，各時(shí)點(diǎn)均無炎性細(xì)胞浸潤，也無梗死灶。缺血6h組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)破壞，排列紊亂，細(xì)胞體積大小不一，形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞空泡樣變，胞核深染，核膜不清，核仁不明顯，間質(zhì)疏松，呈網(wǎng)狀改變，血管周圍間隙增寬。缺血48h組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元缺血性損害加重，進(jìn)一步變性壞死、溶解，間質(zhì)更加疏松，空泡樣變明顯。缺血72h組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元缺血性損害進(jìn)一步加重，變性壞死、溶解，間質(zhì)更加疏松，空泡樣變明顯。

3討論

中醫(yī)證候是機(jī)體生理病理整體反應(yīng)狀態(tài)的概括，四診信息實(shí)際上就是證候的表征。動(dòng)物證候表征研究具有較好的穩(wěn)定性、可視性、可測性和可重復(fù)性［2］。mcao大鼠模型是國內(nèi)外研究缺血性中風(fēng)的經(jīng)典模型，改進(jìn)后的線栓法簡便、易重復(fù)，降低了動(dòng)物死亡率，提高了成功率，復(fù)制的可逆性局灶性腦缺血模型是研究腦缺血再灌注損傷較為理想的模型［3］。在MCAO大鼠模型、雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎大鼠模型、單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎大鼠模型的3種腦缺血模型中，MCAO模型可能為最合適的誘發(fā)血瘀證生物表征的腦缺血模型［4］。本研究結(jié)果顯示，MCAO大鼠模型呈現(xiàn)活動(dòng)減少、蜷縮、精神萎靡、毛色枯槁、飲食減少、體質(zhì)量明顯下降、肛周污染、稀便、舌質(zhì)紫暗等癥狀，造模初期可見偏癱癥狀明顯，表現(xiàn)為右側(cè)肢體廢用或力弱，行走呈順鐘向追尾狀，甚則向一側(cè)傾倒。MCAO大鼠模型臨床表現(xiàn)符合腎虛血瘀證候標(biāo)準(zhǔn)［5］。

中醫(yī)認(rèn)為，“年四十而陰氣自半，起居衰矣”，年老腎精不足，元?dú)馓澨摚K腑功能衰弱，肢體活動(dòng)遲緩，氣血運(yùn)行緩慢，血流不暢致腦脈瘀滯不通而發(fā)中風(fēng)。正如《醫(yī)林改錯(cuò)•王清任》曰:“半身不遂，虧損元?dú)猓瞧浔驹础！薄夺t(yī)學(xué)衷中參西錄•張錫純》亦云:“人之腦髓空者……甚或猝然昏厥，知覺運(yùn)動(dòng)俱廢。”下丘腦-垂體-腎上腺軸是機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)重要的組成部分。雖有報(bào)道顯示與正常人比較，腎陽虛患者尿17羥皮質(zhì)類固醇降低，而腎陰虛患者時(shí)高時(shí)低、變化不定［6］。但隨著年齡的增長，血清皮質(zhì)醇水平逐漸上升，高齡老年者更加明顯［7］。神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的功能失調(diào)將進(jìn)一步加重腦缺血再灌注后的神經(jīng)元損傷。腦缺血再灌注后2～24h時(shí)間內(nèi)，實(shí)驗(yàn)大鼠血漿的ACTH、CORT含量明顯增高［8］。腦缺血后大鼠垂體體質(zhì)量明顯減輕，血漿CRH、ACTH和CORT濃度呈一致性先短暫升高后持續(xù)下降［9］。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠在缺血6h時(shí)血清CORT增高，隨著缺血時(shí)間的延長，血清CORT進(jìn)一步增高，表明大鼠存在神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂。

MCAO30min缺血側(cè)基底結(jié)區(qū)首先出現(xiàn)大量的暗神經(jīng)元和壞死，至MCAO1h這些改變逐漸擴(kuò)展到皮層。如果組織持續(xù)缺血、壞死和暗神經(jīng)元將在組織水腫期后急劇增多，這些改變并不因組織灌注的恢復(fù)而逆轉(zhuǎn)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠腦組織形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯改變，在梗死側(cè)皮層區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)破壞，排列紊亂，而缺血48h組、72h組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元變性壞死、溶解，間質(zhì)更加疏松，空泡樣變明顯。本研究從MCAO大鼠模型臨床表征及生物學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行探討，表明MCAO大鼠存在明顯的腎虛血瘀證候，為中醫(yī)藥研究腦中風(fēng)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

作者：吳相春王少卿唐璐朱文浩高穎單位：北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科