pten基因重組腺病毒對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用范文
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作者：林觀平,熊亮,李樹梅,黃秀蘭,周克元
【摘要】目的:觀察攜帶野生型pten基因的重組腺病毒(Adpten)體外轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞后的表達(dá)，并研究其對(duì)卵巢癌細(xì)胞抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和抑制遷移的作用.方法:利用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建Adpten，體外轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，熒光顯微鏡檢測(cè)Adpten的轉(zhuǎn)染效率.Western印跡檢測(cè)pten在HO8910PM細(xì)胞中的表達(dá)；MTT實(shí)驗(yàn)觀察pten對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；HE染色法觀察外源性pten基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察pten對(duì)細(xì)胞遷移的抑制作用；Hoechest33258凋亡染色檢測(cè)pten基因?qū)O8910PM細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用.結(jié)果:外源性野生型pten基因經(jīng)腺病毒介導(dǎo)成功轉(zhuǎn)入HO8910PM細(xì)胞，Western印跡檢測(cè)出有PTEN蛋白的表達(dá)，當(dāng)感染復(fù)數(shù)MOI為100時(shí)，體外轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%以上.pten顯著抑制HO8910PM細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡并能抑制其遷移.結(jié)論:重組腺病毒是高效的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，能將pten目的基因高效地轉(zhuǎn)移到高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞中，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)有力的生長(zhǎng)抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，并能抑制其遷移.
【關(guān)鍵詞】卵巢腫瘤；基因治療；pten基因；腺病毒；細(xì)胞凋亡；遷移抑制
0引言
抑癌基因pten，即第10號(hào)染色體缺失的與張力蛋白同源的基因，是繼p53后又一個(gè)與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的抑癌基因，其編碼具有雙重特異磷酸酶活性的蛋白，可以反向調(diào)控磷脂酰肌醇(3)激酶（phosphatidylinositol3kinase，PI3K）/AKt信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖.其突變和缺失多發(fā)于乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等［1-3］.在某些pten基因突變或缺失的癌細(xì)胞中過表達(dá)PTEN蛋白能抑制細(xì)胞增殖和腫瘤的形成，使其細(xì)胞周期停滯在G1期并發(fā)生細(xì)胞凋亡［4-5］，而且在某些沒有pten基因突變的癌細(xì)胞中,使pten基因過表達(dá)也能抑制這些癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡［6］；另外，pten基因還能抑制癌細(xì)胞的侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移，降低其遷移能力.這就提示pten基因用于癌癥基因治療有著重要意義.而基因治療載體的選擇最為重要，當(dāng)今運(yùn)用最多最廣泛的就是腺病毒(adenovirus,Ad)載體，其具有在哺乳動(dòng)物及其他多種生物細(xì)胞上進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移和蛋白表達(dá)的高效性和不整合宿主細(xì)胞的性質(zhì)，是一種比較安全，轉(zhuǎn)染效率又高的載體［7］.本研究采用攜帶野生型pten基因的重組腺病毒(Adpten)，將pten基因?qū)肴烁咿D(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，觀察其在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)，研究其對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、遷移抑制、誘導(dǎo)凋亡的作用，對(duì)卵巢癌的基因治療進(jìn)行初步的探索并提供有意義的參考數(shù)據(jù).
1材料和方法
1.1材料人高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞293T購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；野生型pten表達(dá)質(zhì)粒（wtpten）為美國(guó)加州大學(xué)FrankFurnari教授惠贈(zèng)；AdEasy腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)由美國(guó)休斯霍華德醫(yī)學(xué)院及JohnHopkins腫瘤中心BertVogelstein教授惠贈(zèng)，其中穿梭載體pAdTrackCMV帶有綠色熒光蛋白報(bào)告基因(gfp)，在表達(dá)外源基因同時(shí)也能單獨(dú)表達(dá)gfp，用于重組腺病毒的快速篩選以及轉(zhuǎn)染率的測(cè)定；抗PTEN抗體為美國(guó)SantaCruz公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體和馬抗山羊IgG均購自北京生物技術(shù)有限公司；MTT為美國(guó)Amerson公司產(chǎn)品.Hoechst33258細(xì)胞凋亡染色試劑盒購于武漢碧云天生物技術(shù)公司.
1.2方法
1.2.1重組腺病毒載體的構(gòu)建及細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法，構(gòu)建攜帶野生型pten基因的重組腺病毒Adpten及陰性對(duì)照Adgfp［8］.HO8910PM細(xì)胞培養(yǎng)于含100mL/L小牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置50mL/LCO2,37℃孵箱培養(yǎng).
1.2.2Adpten轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定取指數(shù)生長(zhǎng)期的高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，以5×104/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，24h后吸棄培養(yǎng)基，換無血清RPMI1640培養(yǎng)基，用25，50，100感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,MOI=病毒顆粒數(shù)/轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù))的腺病毒感染,培養(yǎng)6h后，換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).24h后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)gfp陽性細(xì)胞百分率.確定HO8910PM細(xì)胞轉(zhuǎn)染所需的MOI值，使得轉(zhuǎn)染效率＞90%.
1.2.3WesternBlot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的PTEN蛋白取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按2×106接種于25cm2培養(yǎng)瓶中.常規(guī)條件培養(yǎng)24h后，按MOI=100加入病毒，設(shè)Adpten組和Adgfp組，培養(yǎng)6h后，換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).48h后提取細(xì)胞總蛋白；以Bradford酶標(biāo)儀蛋白定量法測(cè)定蛋白含量，然后作SDSPAGE（12g/L），于4℃冰箱中90mA恒流電轉(zhuǎn)過夜，使目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,封閉液于4℃封閉過夜，將膜轉(zhuǎn)至新的封袋中，按0.1mL/cm2加入適量的一抗稀釋液（小鼠抗人PTEN單抗按1∶300封閉液稀釋，山羊抗人Actin多抗按1∶500封閉液稀釋），封口后，室溫下平緩搖動(dòng)反應(yīng)4h.TBS洗滌后加入二抗稀釋液（PTEN,Actin的二抗均按1∶2000封閉液稀釋），同條件反應(yīng)1h.大量TBS洗滌去除未結(jié)合的二抗.ECL（化學(xué)發(fā)光）處理，暗箱中以X光膠片曝光，顯影、定影.
1.2.4MTT法測(cè)定HO8910PM細(xì)胞增殖抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×103/孔接種于96孔板培養(yǎng)，常規(guī)條件培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)基，換無血清RPMI1640培養(yǎng)基，按MOI=100加入病毒，設(shè)Adpten組，Adgfp組，PBS空白對(duì)照組和本底對(duì)照組(只加完全培養(yǎng)液，不種細(xì)胞)，培養(yǎng)6h后，換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).每個(gè)
時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)平行孔，在指定時(shí)間(24,48,72h)加入MTT(5mg/mL)20μL/孔，孵育4h后，小心吸棄孔內(nèi)上清液，加入DMSO150μL/孔，振蕩10min，490nm作為測(cè)定波長(zhǎng)，570nm作為參比波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的光吸收值.細(xì)胞增殖抑制率=［1-實(shí)驗(yàn)組（A570nm-A490nm）/本底對(duì)照組（A570nm-A490nm）］×100%.
1.2.5HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)取指數(shù)生長(zhǎng)期高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，以5×104接種于35mm培養(yǎng)皿中，24h貼壁后，加入Adpten或Adgfp感染，并設(shè)加PBS為空白對(duì)照；病毒感染方法同1.2.4，24h后棄培養(yǎng)基，生理鹽水漂洗，950mL/L乙醇固定15min，蘇木素染色3～10min，自來水沖洗5～8min，5～10mL/L鹽酸酒精分化數(shù)分鐘，自來水沖洗5～8min，然后加溫?zé)崴?～10min顯藍(lán)，自來水充分沖洗，伊紅復(fù)染2min，再次用自來水充分沖洗，普通光學(xué)顯微鏡下觀察.
1.2.6細(xì)胞劃痕試驗(yàn)取指數(shù)生長(zhǎng)期高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，按2×104/孔接種于6孔培養(yǎng)板，用RPMI1640完全培養(yǎng)基孵育24h后，用移液槍槍尖在細(xì)胞培養(yǎng)基表面劃一條痕跡（長(zhǎng)約2cm），用PBS洗3次后加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基，病毒感染方法同1.2.4，設(shè)加PBS為空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48h后鏡下觀察.
1.2.7Hoechst33258凋亡染色取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HO8910PM細(xì)胞2×104/孔接種于6孔板，病毒感染方法同1.2.4，設(shè)加PBS為空白對(duì)照，48h后用固定液固定10min，PBS洗2次，Hoechst33258染色5min，熒光顯微鏡下觀察.
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:本實(shí)驗(yàn)采用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.
2結(jié)果
2.1Adpten對(duì)HO8910PM細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定Adpten在體外感染人高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率.在MOI=100時(shí)可以達(dá)到90%以上（圖1）.
A:熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá);B:同一視野下光學(xué)顯微鏡觀察.
圖1Adpten(MOI=100)感染HO8910PM細(xì)胞的效果×200
2.2Western檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PTEN蛋白的表達(dá)Western印跡分析結(jié)果表明，Adgfp感染后的HO8910PM細(xì)胞未見特異性條帶；而Adpten感染后的HO8910PM細(xì)胞，則見到特異性條帶，而且Pten蛋白表達(dá)量也較高（圖2）.
圖2WesternBlot檢測(cè)PTEN蛋白的表達(dá)
2.3Adpten對(duì)HO8910PM細(xì)胞增殖的影響以MOI=100病毒感染后24，48，72h，通過吸光度值計(jì)算，Adpten的抑制率分別為(89.76±1.49)%,(91.11±1.38)%,(92.38±1.78)%,而Adgfp感染組分別為(8.14±2.16)%,(7.82±2.32)%,(6.16±2.86)%，二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）.
2.4Adpten對(duì)HO8910PM細(xì)胞形態(tài)的影響重組腺病毒Adpten感染及非病毒感染(對(duì)照)的3組HO8910PM細(xì)胞,經(jīng)HE染色光鏡下觀察可見，正常對(duì)照及Adgfp處理組細(xì)胞成片生長(zhǎng)，細(xì)胞間隙緊密，胞質(zhì)舒展，核分裂現(xiàn)象明顯.Adpten處理組細(xì)胞則細(xì)胞間隙變大，胞質(zhì)紅，核固縮，易見凋亡小體(圖3).
A:PBS對(duì)照組;B:Adgfp處理組;C:Adpten處理組.
圖3Adpten感染對(duì)HO8910PM細(xì)胞形態(tài)的影響HE×400
2.5Adpten對(duì)HO8910PM細(xì)胞遷移能力的影響重組腺病毒Adpten感染后的指數(shù)生長(zhǎng)期高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞與對(duì)照組(PBS空白組和Adgfp組)比較，Adpten能有效地抑制HO8910PM細(xì)胞的遷移（圖4）.
2.6Adpten誘導(dǎo)HO8910PM細(xì)胞凋亡Hoechst33258熒光染色結(jié)果顯示,重組腺病毒Adpten感染HO8910PM細(xì)胞48h后，Adpten感染組出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，可見胞體縮小、胞漿濃縮、核染色質(zhì)聚集、核固縮，還可見膜包裹的凋亡小體.而PBS對(duì)照組和Adgfp組的細(xì)胞均未發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變（圖5）.
3討論
隨著分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的發(fā)展，癌基因的激活和抑癌基因的突變失活，是目前較為公認(rèn)的腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一.本文研究的抑癌基因pten，其突變和缺失常見于多種惡性腫瘤，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系.目前普遍使用的腫瘤的基因治療方法是導(dǎo)入外源性野生型抑癌基因補(bǔ)充或替代突變的抑癌基因.我們選用重組腺病毒載體導(dǎo)入抑A0,A1:PBS對(duì)照組;B0,B1:Adgfp處理組;C0,C1:Adpten處理組;A0,B0,C0:0h;A1,B1,C1:感染后48h.
癌基因pten，其極少發(fā)生插入突變，載體操作方便、宿主廣泛、容易繁殖，并具有攜帶外源基因容量大，可表達(dá)接近翻譯后成熟水平蛋白質(zhì)等特點(diǎn)，已廣泛用于多種疾病的體內(nèi)基因治療.國(guó)外報(bào)道的AdEasy系統(tǒng)［9］除具有腺病毒載體的一般優(yōu)點(diǎn)外，還具備以下優(yōu)點(diǎn)：①在細(xì)菌體內(nèi)完成同源重組，重組效率高，周期短；②利用含不同抗生素篩選重組子，簡(jiǎn)化了篩選工作；③經(jīng)重組的腺病毒帶有g(shù)fp基因，可直接通過熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)病毒的生成，病毒滴度的測(cè)定和對(duì)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的檢測(cè)都較傳統(tǒng)方法簡(jiǎn)便易行.我們利用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建了攜帶野生型pten基因的重組腺病毒，導(dǎo)入人高轉(zhuǎn)移卵巢癌H
O8910PM細(xì)胞，證實(shí)pten基因在HO8910PM細(xì)胞中能高效地表達(dá).通過MTT比色檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Adpten對(duì)HO8910PM細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用，能有效地抑制該癌細(xì)胞生長(zhǎng).細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證明Adpten能有效地抑制該癌細(xì)胞的遷移.Hoechst33258凋亡染色結(jié)果也表明pten具有誘導(dǎo)該癌細(xì)胞凋亡的作用.
本研究結(jié)果表明，攜帶野生型pten基因的重組腺病毒是一種高效的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，能將pten目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，對(duì)人高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)有力的生長(zhǎng)抑制及凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，并能抑制該癌細(xì)胞遷移，為進(jìn)一步的基因治療卵巢癌的研究奠定了基礎(chǔ).
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