反義抑制Survivin表達(dá)對(duì)槲皮素誘導(dǎo)肝癌SSMC7721細(xì)胞凋亡范文

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作者：李安強(qiáng),郭天康,李榮范,顧遠(yuǎn)暉,蔡輝

【摘要】目的：采用Survivin反義寡核苷酸(ASODN)復(fù)合物抑制survivin的表達(dá)，研究其對(duì)槲皮素誘導(dǎo)肝癌ssmc7721細(xì)胞凋亡的影響.方法：體外培養(yǎng)人肝癌SSMC7721細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)分Ⅰ,Ⅱ兩部分：Ⅰ分為空白對(duì)照組(設(shè)平行組)、等量脂質(zhì)體LipofectamineTM2000對(duì)照組、400μmol/LSODN復(fù)合物組、400μmol/LASODN復(fù)合物組(設(shè)平行組)，轉(zhuǎn)染48h;Ⅱ棄掉Ⅰ部分各組培養(yǎng)液，換新指定培養(yǎng)液，分為空白對(duì)照組、40μmol/L槲皮素組、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000組、SODN復(fù)合物組、ASODN復(fù)合物組、ASODN復(fù)合物+40μmol/L槲皮素組(聯(lián)合組)，孵育細(xì)胞24h后檢測(cè).Ⅰ結(jié)束時(shí)采用RTPCR、細(xì)胞免疫組化染色檢測(cè)各組SSMC7721細(xì)胞survivin表達(dá)變化；Ⅱ結(jié)束時(shí)用吖啶橙染色法觀察細(xì)胞凋亡時(shí)形態(tài)變化，MTT法檢測(cè)SSMC7721細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，AnnexiV/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)SSMC7721細(xì)胞凋亡率.結(jié)果：ASODN復(fù)合物作用肝癌SSMC7721細(xì)胞48h后能下調(diào)survivinmRNA及Survivin蛋白的表達(dá)(P<0.01)；與其他組比較，聯(lián)合組AO染色圖片可觀察到凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)特征變化且凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并用MTT法、AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示聯(lián)合組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率增高(P<0.01)、細(xì)胞凋亡率提高(P<0.01).結(jié)論:ASODN復(fù)合物可有效抑制肝癌SSMC7721細(xì)胞survivin基因的表達(dá)；ASODN復(fù)合物能增強(qiáng)槲皮素對(duì)SSMC7721細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用即二者具有協(xié)同作用，該作用可能與抑制survivin基因的表達(dá)有關(guān).

【關(guān)鍵詞】反義寡核苷酸；槲皮素；肝腫瘤；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期；Survivin

0引言

肝癌(hepaticcarcinoma,HCC)是世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，對(duì)于大多數(shù)肝癌患者，經(jīng)肝動(dòng)脈化學(xué)藥物栓塞治療和全身化療仍是最常用的治療方法.近年來(lái)抗凋亡機(jī)制在腫瘤細(xì)胞耐藥性發(fā)生中的作用倍受關(guān)注［1］.survivin是1997年由Ambrosini等［2］發(fā)現(xiàn)，Ito等［3］報(bào)道Survivin蛋白對(duì)破壞肝癌細(xì)胞增生凋亡平衡、促進(jìn)肝癌細(xì)胞快速增生具有重要作用.槲皮素(quercetin,Quc)是廣泛分布于蔬菜、水果、中草藥等的一種天然的黃酮類化合物，化學(xué)名為3,3′,4′,5,7五羥基黃酮.LopezLazaro等［4］研究表明，Quc沒(méi)有毒副作用.近年來(lái)的研究表明Quc在體外、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭芯@示出抗癌活性［4-6］.本實(shí)驗(yàn)旨在研究反義抑制survivin的表達(dá)，檢測(cè)其對(duì)Quc抑制肝癌SSMC7721生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響，探討反義抑制survivin的表達(dá)是否在體外可增強(qiáng)Quc抗癌作用及可能的機(jī)制，為其進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1材料和方法

1.1材料人肝癌細(xì)胞株SSMC7721蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供.RPMI1640(Sigma公司)，小牛血清(杭州四季清公司)，槲皮素(Sigma公司,用前以少量DMSO溶解，用時(shí)加RPMI1640稀釋至使用濃度)，MTT(Sigma公司),Trizol(BBI公司)，Survivin蛋白一抗兔抗人抗體、二抗羊抗兔抗體(北京中山公司)，TaKaRa試劑盒(寶生物工程公司)，AnnexiV/PI試劑盒(寶靈試劑公司),陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Invitrogen公司).寡核苷酸(ODNs)脂質(zhì)體(Lip)轉(zhuǎn)染復(fù)合物survivin正、反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)、合成：根據(jù)survivin的基因序列(GenBankAccessionNumberU75285),應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)互補(bǔ)于survivinmRNA的232-251序列的20個(gè)堿基組成的ASODN鏈：5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG3′,同時(shí)合成正義鏈：5′CGCAGTAGCTGCGCTGATTG3′,兩條鏈均采用硫代磷酸化修飾.在GenBank中證實(shí)反義寡核苷酸(ASODN)及正義寡核苷酸(SODN)與任何已知哺乳動(dòng)物基因無(wú)匹配，上海生工公司合成.用LipofectamineTM2000輸送ODNs，依文獻(xiàn)［7］ODNs/LipoTM2000=4g/L配置ODNsLipoTM2000轉(zhuǎn)染復(fù)合物，按質(zhì)脂體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作.

1.2方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SSMC7721細(xì)胞，消化、收集、計(jì)數(shù)并接種于96孔或6孔培養(yǎng)板或100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶.

1.2.1分組實(shí)驗(yàn)分Ⅰ,Ⅱ兩部分：Ⅰ分為空白對(duì)照組(設(shè)平行組)、等量脂質(zhì)體LipofectamineTM2000對(duì)照組、400μmol/LSODN復(fù)合物組、400μmol/LASODN復(fù)合物組(設(shè)平行組)，轉(zhuǎn)染48h;Ⅱ棄掉Ⅰ部分培養(yǎng)液，換新指定培養(yǎng)液，分為空白對(duì)照組、40μmol/L槲皮素組、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000組、SODN復(fù)合物組、ASODN復(fù)合物組、ASODN復(fù)合物+40μmol/L槲皮素組，孵育細(xì)胞24h后檢測(cè).

1.2.2RTPCR檢測(cè)SSMC7721細(xì)胞survivinmRNA表達(dá)變化在實(shí)驗(yàn)Ⅰ部分結(jié)束時(shí)，按Takara試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行，收集各組細(xì)胞，Trizol提取總RNA,用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)純度并定量.設(shè)βactin為內(nèi)參照，對(duì)樣品模板用量標(biāo)準(zhǔn)化,survivin和βactin分管擴(kuò)增,引物由上海生工公司合成.其序列如下：survivin引物序列5′AAAGAGCCAAGAACAAAATTGC3′(F)和5′GAGAGAGAAGCAGCCACTGTTAC3′(R),338bp;βactin引物序列5′CTTCTACAATGAGCTGCGTG

3′(F)和5′TCATGAGGTAGTCAGTCAGG3′(R),243bp.10μL逆轉(zhuǎn)錄體系用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min完成逆轉(zhuǎn)錄.10μLcDNA用于PCR反應(yīng),分別單獨(dú)加入相應(yīng)上下游引物等在50μLPCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng).94℃預(yù)變性2min后進(jìn)入PCR循環(huán)，條件：survivin和βactin，94℃變性30s,54℃復(fù)性30s,72℃延伸30s,共35個(gè)循環(huán)；RTPCR產(chǎn)物8μL在18g/L瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)凝膠圖像分析儀分析結(jié)果，以survivin與βactin的比值作為survivinmRNA表達(dá)的相對(duì)含量.

1.2.3細(xì)胞免疫組化染色檢測(cè)SSMC7721細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)變化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于預(yù)先置入蓋玻片6孔板進(jìn)行細(xì)胞爬片，在實(shí)驗(yàn)Ⅰ部分處理結(jié)束時(shí)，取出各組爬片細(xì)胞，PBS液輕輕漂洗，750mL/L乙醇固定，按試劑盒操作步驟進(jìn)行細(xì)胞免疫染色.以正常鼠血清和磷酸鹽緩沖液分別代替一抗行替代對(duì)照和空白對(duì)照.于普通光學(xué)顯微鏡下觀察，以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞Survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率.

1.2.4吖啶橙(AO)染色法觀察細(xì)胞凋亡時(shí)形態(tài)變化消化、收集實(shí)驗(yàn)Ⅰ,Ⅱ兩部分處理的各組細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，制成單細(xì)胞懸液，濃度1010個(gè)/L,750mL/L乙醇固定4h,離心棄乙醇，加入8.5mg/L的AO2mL工作液，室溫染10min后，滴幾滴在載玻片，加緩沖甘油封片.在熒光顯微鏡下用吸收波長(zhǎng)405nm,發(fā)射波長(zhǎng)550~630nm觀察，并隨機(jī)拍照.

1.2.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SSMC7721細(xì)胞，消化、收集、計(jì)數(shù)并接種于96孔板，每孔2×103個(gè)，并設(shè)3個(gè)復(fù)孔.實(shí)驗(yàn)設(shè)數(shù)個(gè)平行板，分Ⅰ,Ⅱ兩部分；到實(shí)驗(yàn)預(yù)定點(diǎn)前4h加5g/L的MTT10μL，37℃反應(yīng)4h，棄掉MTT，加200μLDMSO,輕輕振蕩10min,使結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm波長(zhǎng)A值.計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(inhibitoryrate，IR).重復(fù)2次，取平均值.IR(%)=(A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A對(duì)照組×100%.

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率消化、收集經(jīng)實(shí)驗(yàn)Ⅰ,Ⅱ兩部分各處理組細(xì)胞，按AnnexinV細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，加入Bindingbuffer緩沖液200μL、AnnexinV/FITC(20mg/L)10μL和PI液(50mg/L)5μL，室溫避光孵育30min后加入Bindingbuffer緩沖液300μL，立即用流式細(xì)胞儀FACScan(BeclonDickison公司)測(cè)定，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)2遍.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示；應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析，并進(jìn)行兩兩比較(q檢驗(yàn)).以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1ASODN反義復(fù)合物對(duì)肝癌SSMC772細(xì)胞survivinmRNA表達(dá)的影響RTPCR檢測(cè)survivinmRNA水平顯示400nmol/LASODN反義復(fù)合物組(0.21±0.03)較空白對(duì)照組(0.99±0.02)、等量脂質(zhì)體LipofectamineTM2000對(duì)照組(0.94±0.03),400nmol/LSODN復(fù)合物組(0.94±0.03)RTPCR擴(kuò)增的條帶減弱(P<0.01).通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像分析結(jié)果表明，400nmol/LASODN反義復(fù)合物組與空白對(duì)照組、等量脂質(zhì)體LipofectamineTM2000對(duì)照組、400nmol/LSODN復(fù)合物組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其他各組間相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2.2ASODN反義復(fù)合物對(duì)肝癌SSMC772細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的影響細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果顯示，400nmol/LASODN反義復(fù)合物組(19.7±3.7)%較空白對(duì)照組(76.5±8.7)%、等量脂質(zhì)體LipofectamineTM2000對(duì)照組(74.5±8.2)%,400nmol/LSODN復(fù)合物組(73.9±7.9)%Survivin蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).

2.3細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化ASODN反義復(fù)合物聯(lián)合槲皮素組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯較空白對(duì)照組、等量脂質(zhì)體LipofectamineTM2000對(duì)照組、SODN復(fù)合物組、ASODN復(fù)合物組及槲皮素組增加，活細(xì)胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)成紅色熒光.凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見(jiàn)細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體等典型改變(圖1).

2.4MTT法檢測(cè)SSMC7721細(xì)胞增殖變化ASODN復(fù)合物組（28.4%）或槲皮素組（43.1%）可抑SSMC7721細(xì)胞增殖(P<0.01)，而脂質(zhì)體組（1.7%）則無(wú)此效，ASODN反義復(fù)合物聯(lián)合槲皮素時(shí)表現(xiàn)出協(xié)同抑制細(xì)胞增殖作用（69.8%），兩藥聯(lián)合對(duì)細(xì)胞的增殖抑制效果高于單用ASODN復(fù)合物組（28.4%，P<0.01)和槲皮素組(43.1%，P<0.01).

2.5細(xì)胞凋亡率的變化與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組相比，ASODN復(fù)合物組、槲皮素組、ASODN復(fù)合物+槲皮素組均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率(Annevix(+)PI(-))分別是脂質(zhì)體組的3.1倍、4.3倍、18.2倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，ASODN復(fù)合物聯(lián)合槲皮素組與ASODN復(fù)合物組、槲皮素組比較，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率分別是他們的5.9倍、4.2倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，并且各組間流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)損傷率(Annexin(+)PI(+))無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）.表1各組細(xì)胞凋亡率變化

3討論

Survivin的組織分布特征具有明顯的選擇性，其表達(dá)于胚胎和發(fā)育

的胎兒組織，但不見(jiàn)于終末分化的成人組織(胸腺、生殖腺除外)，而表達(dá)于大多數(shù)腫瘤組織中［8-9］，使它成為一個(gè)癌的分子標(biāo)志和治療靶點(diǎn).研究發(fā)現(xiàn)，Survivin能夠通過(guò)桿狀病毒IAP重復(fù)序列(BIR)作用于Caspase3,Caspase7來(lái)抑制凋亡蛋白酶活性，阻止多種凋亡信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而且能在細(xì)胞有絲分裂前期通過(guò)與紡錘體微管發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞周期G2/M期檢測(cè)點(diǎn)的監(jiān)控，抵抗因DNA損傷或突變自身誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常分裂增殖［10］，另外Survivin蛋白亦可通過(guò)p21蛋白間接抑制caspase酶而起作用,阻斷細(xì)胞的凋亡過(guò)程,其抑制細(xì)胞凋亡的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于bcl2家族成員,是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子.Survivin的高表達(dá)可以使腫瘤細(xì)胞免受各種凋亡信號(hào)的刺激而幫助細(xì)胞存活［11-12］.槲皮素(Quercetin)是具有多種生物活性的黃酮類化合物，其維生素P樣的作用已應(yīng)用于臨床.國(guó)內(nèi)外已有研究顯示，槲皮素是目前已知的最強(qiáng)的抗癌劑之一，能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡［13］，同時(shí)槲皮素還有抗炎、抗過(guò)敏、抗氧化、降血脂、降壓等生理活性.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用反義核酸技術(shù)，用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)人工合成的特定DN段ASODN分子轉(zhuǎn)染SSMC7721細(xì)胞，人工合成的特定DN段ASODN分子與進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的survivinmRNA上的特定位點(diǎn)相結(jié)合，形成DNARNA復(fù)合物，抑制survivinmRNA與核糖體結(jié)合，同時(shí)激活RNA降解酶H，降解survivinmRNA，從而抑制或封閉基因的表達(dá)，干擾survivin致病蛋白的產(chǎn)生［14］.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ASODN復(fù)合物作用于肝癌SSMC7721細(xì)胞48h后，采用RTPCR和細(xì)胞免疫組化檢測(cè)示與空白對(duì)照組比較，ASODN復(fù)合物組survivinmRNA、Survivin蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而等量脂質(zhì)體組、SODN復(fù)合物組survivinmRNA、Survivin蛋白表達(dá)變化差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)證明了ASODN復(fù)合物可有效抑制survivin基因的表達(dá).實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用等劑量的槲皮素(亞致死濃度)處理實(shí)驗(yàn)Ⅰ部分各實(shí)驗(yàn)組肝癌SSMC7721細(xì)胞24h后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與其它組比較，ASODN復(fù)合物+40μmol/L槲皮素組(聯(lián)合組)AO染色法觀察在相同條件聯(lián)合組滿視野見(jiàn)典型細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化且凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，MTT法、AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)示在同等條件聯(lián)合組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和細(xì)胞凋亡率明顯高于其它組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.也就是有效封閉肝癌SSMC7721細(xì)胞survivin基因的表達(dá)能增強(qiáng)槲皮素對(duì)該細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用即ASODN反義復(fù)合物聯(lián)合槲皮素對(duì)肝癌SSMC7721細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用具有協(xié)同效應(yīng).實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，SSMC7721細(xì)胞survivin基因表達(dá)降低后，其抗凋亡能力被有效抑制了，推測(cè)聯(lián)合組對(duì)肝癌細(xì)胞的協(xié)同細(xì)胞毒性導(dǎo)致的凋亡可能是通過(guò)兩個(gè)凋亡途徑的共同通路［15］即激活Caspase效應(yīng)子而實(shí)現(xiàn)的.至于是通過(guò)死亡受體途徑還是通過(guò)線立體途徑介導(dǎo)的凋亡有待進(jìn)一步研究.

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