反義抑制Survivin表達對槲皮素誘導肝癌SSMC7721細胞凋亡范文

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作者：李安強,郭天康,李榮范,顧遠暉,蔡輝

【摘要】目的：采用Survivin反義寡核苷酸(ASODN)復合物抑制survivin的表達，研究其對槲皮素誘導肝癌ssmc7721細胞凋亡的影響.方法：體外培養人肝癌SSMC7721細胞，取對數生長期細胞進行實驗.實驗分Ⅰ,Ⅱ兩部分：Ⅰ分為空白對照組(設平行組)、等量脂質體LipofectamineTM2000對照組、400μmol/LSODN復合物組、400μmol/LASODN復合物組(設平行組)，轉染48h;Ⅱ棄掉Ⅰ部分各組培養液，換新指定培養液，分為空白對照組、40μmol/L槲皮素組、脂質體LipofectamineTM2000組、SODN復合物組、ASODN復合物組、ASODN復合物+40μmol/L槲皮素組(聯合組)，孵育細胞24h后檢測.Ⅰ結束時采用RTPCR、細胞免疫組化染色檢測各組SSMC7721細胞survivin表達變化；Ⅱ結束時用吖啶橙染色法觀察細胞凋亡時形態變化，MTT法檢測SSMC7721細胞生長抑制率，AnnexiV/PI雙染流式細胞儀檢測SSMC7721細胞凋亡率.結果：ASODN復合物作用肝癌SSMC7721細胞48h后能下調survivinmRNA及Survivin蛋白的表達(P<0.01)；與其他組比較，聯合組AO染色圖片可觀察到凋亡小體等典型的細胞凋亡形態特征變化且凋亡細胞數量明顯增多，并用MTT法、AnnexinV/PI雙染流式細胞儀檢測顯示聯合組細胞的生長抑制率增高(P<0.01)、細胞凋亡率提高(P<0.01).結論:ASODN復合物可有效抑制肝癌SSMC7721細胞survivin基因的表達；ASODN復合物能增強槲皮素對SSMC7721細胞增殖抑制及誘導凋亡的作用即二者具有協同作用，該作用可能與抑制survivin基因的表達有關.

【關鍵詞】反義寡核苷酸；槲皮素；肝腫瘤；細胞凋亡；細胞周期；Survivin

0引言

肝癌(hepaticcarcinoma,HCC)是世界范圍內發病率較高的惡性腫瘤之一，對于大多數肝癌患者，經肝動脈化學藥物栓塞治療和全身化療仍是最常用的治療方法.近年來抗凋亡機制在腫瘤細胞耐藥性發生中的作用倍受關注［1］.survivin是1997年由Ambrosini等［2］發現，Ito等［3］報道Survivin蛋白對破壞肝癌細胞增生凋亡平衡、促進肝癌細胞快速增生具有重要作用.槲皮素(quercetin,Quc)是廣泛分布于蔬菜、水果、中草藥等的一種天然的黃酮類化合物，化學名為3,3′,4′,5,7五羥基黃酮.LopezLazaro等［4］研究表明，Quc沒有毒副作用.近年來的研究表明Quc在體外、動物實驗模型中均顯示出抗癌活性［4-6］.本實驗旨在研究反義抑制survivin的表達，檢測其對Quc抑制肝癌SSMC7721生長和誘導細胞凋亡的影響，探討反義抑制survivin的表達是否在體外可增強Quc抗癌作用及可能的機制，為其進一步動物實驗和臨床應用提供新的實驗依據.

1材料和方法

1.1材料人肝癌細胞株SSMC7721蘭州大學醫學實驗中心提供.RPMI1640(Sigma公司)，小牛血清(杭州四季清公司)，槲皮素(Sigma公司,用前以少量DMSO溶解，用時加RPMI1640稀釋至使用濃度)，MTT(Sigma公司),Trizol(BBI公司)，Survivin蛋白一抗兔抗人抗體、二抗羊抗兔抗體(北京中山公司)，TaKaRa試劑盒(寶生物工程公司)，AnnexiV/PI試劑盒(寶靈試劑公司),陽離子脂質體LipofectamineTM2000(Invitrogen公司).寡核苷酸(ODNs)脂質體(Lip)轉染復合物survivin正、反義寡核苷酸的設計、合成：根據survivin的基因序列(GenBankAccessionNumberU75285),應用Primer5.0軟件設計互補于survivinmRNA的232-251序列的20個堿基組成的ASODN鏈：5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG3′,同時合成正義鏈：5′CGCAGTAGCTGCGCTGATTG3′,兩條鏈均采用硫代磷酸化修飾.在GenBank中證實反義寡核苷酸(ASODN)及正義寡核苷酸(SODN)與任何已知哺乳動物基因無匹配，上海生工公司合成.用LipofectamineTM2000輸送ODNs，依文獻［7］ODNs/LipoTM2000=4g/L配置ODNsLipoTM2000轉染復合物，按質脂體轉染試劑盒說明書進行操作.

1.2方法取對數生長期的SSMC7721細胞，消化、收集、計數并接種于96孔或6孔培養板或100mL細胞培養瓶.

1.2.1分組實驗分Ⅰ,Ⅱ兩部分：Ⅰ分為空白對照組(設平行組)、等量脂質體LipofectamineTM2000對照組、400μmol/LSODN復合物組、400μmol/LASODN復合物組(設平行組)，轉染48h;Ⅱ棄掉Ⅰ部分培養液，換新指定培養液，分為空白對照組、40μmol/L槲皮素組、脂質體LipofectamineTM2000組、SODN復合物組、ASODN復合物組、ASODN復合物+40μmol/L槲皮素組，孵育細胞24h后檢測.

1.2.2RTPCR檢測SSMC7721細胞survivinmRNA表達變化在實驗Ⅰ部分結束時，按Takara試劑盒操作說明書進行，收集各組細胞，Trizol提取總RNA,用紫外分光光度計檢驗純度并定量.設βactin為內參照，對樣品模板用量標準化,survivin和βactin分管擴增,引物由上海生工公司合成.其序列如下：survivin引物序列5′AAAGAGCCAAGAACAAAATTGC3′(F)和5′GAGAGAGAAGCAGCCACTGTTAC3′(R),338bp;βactin引物序列5′CTTCTACAATGAGCTGCGTG

3′(F)和5′TCATGAGGTAGTCAGTCAGG3′(R),243bp.10μL逆轉錄體系用于逆轉錄合成cDNA,30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min完成逆轉錄.10μLcDNA用于PCR反應,分別單獨加入相應上下游引物等在50μLPCR反應體系進行PCR反應.94℃預變性2min后進入PCR循環，條件：survivin和βactin，94℃變性30s,54℃復性30s,72℃延伸30s,共35個循環；RTPCR產物8μL在18g/L瓊脂糖凝膠上電泳，經凝膠圖像分析儀分析結果，以survivin與βactin的比值作為survivinmRNA表達的相對含量.

1.2.3細胞免疫組化染色檢測SSMC7721細胞Survivin蛋白表達變化取對數生長期細胞于預先置入蓋玻片6孔板進行細胞爬片，在實驗Ⅰ部分處理結束時，取出各組爬片細胞，PBS液輕輕漂洗，750mL/L乙醇固定，按試劑盒操作步驟進行細胞免疫染色.以正常鼠血清和磷酸鹽緩沖液分別代替一抗行替代對照和空白對照.于普通光學顯微鏡下觀察，以細胞核或細胞質出現棕褐色或棕黃色顆粒為陽性，隨機選取5個高倍視野進行計數，每個高倍視野計數100個細胞，共500個細胞，計算細胞Survivin蛋白陽性表達率.

1.2.4吖啶橙(AO)染色法觀察細胞凋亡時形態變化消化、收集實驗Ⅰ,Ⅱ兩部分處理的各組細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，制成單細胞懸液，濃度1010個/L,750mL/L乙醇固定4h,離心棄乙醇，加入8.5mg/L的AO2mL工作液，室溫染10min后，滴幾滴在載玻片，加緩沖甘油封片.在熒光顯微鏡下用吸收波長405nm,發射波長550~630nm觀察，并隨機拍照.

1.2.5MTT法檢測細胞增殖變化取對數生長期的SSMC7721細胞，消化、收集、計數并接種于96孔板，每孔2×103個，并設3個復孔.實驗設數個平行板，分Ⅰ,Ⅱ兩部分；到實驗預定點前4h加5g/L的MTT10μL，37℃反應4h，棄掉MTT，加200μLDMSO,輕輕振蕩10min,使結晶溶解，酶標儀檢測570nm波長A值.計算細胞生長抑制率(inhibitoryrate，IR).重復2次，取平均值.IR(%)=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%.

1.2.6流式細胞儀檢測細胞凋亡率消化、收集經實驗Ⅰ,Ⅱ兩部分各處理組細胞，按AnnexinV細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，加入Bindingbuffer緩沖液200μL、AnnexinV/FITC(20mg/L)10μL和PI液(50mg/L)5μL，室溫避光孵育30min后加入Bindingbuffer緩沖液300μL，立即用流式細胞儀FACScan(BeclonDickison公司)測定，經計算機軟件處理，計算凋亡細胞百分率,實驗重復2遍.

統計學處理:實驗數據以x±s表示；應用SPSS13.0統計軟件進行分析，采用單因素方差分析，并進行兩兩比較(q檢驗).以P<0.05認為差異有統計學意義.

2結果

2.1ASODN反義復合物對肝癌SSMC772細胞survivinmRNA表達的影響RTPCR檢測survivinmRNA水平顯示400nmol/LASODN反義復合物組(0.21±0.03)較空白對照組(0.99±0.02)、等量脂質體LipofectamineTM2000對照組(0.94±0.03),400nmol/LSODN復合物組(0.94±0.03)RTPCR擴增的條帶減弱(P<0.01).通過計算機圖像分析結果表明，400nmol/LASODN反義復合物組與空白對照組、等量脂質體LipofectamineTM2000對照組、400nmol/LSODN復合物組相比較差異有統計學意義(P<0.01)，其他各組間相比較差異無統計學意義.

2.2ASODN反義復合物對肝癌SSMC772細胞Survivin蛋白表達的影響細胞免疫組化染色結果顯示，400nmol/LASODN反義復合物組(19.7±3.7)%較空白對照組(76.5±8.7)%、等量脂質體LipofectamineTM2000對照組(74.5±8.2)%,400nmol/LSODN復合物組(73.9±7.9)%Survivin蛋白表達明顯下調，差異有統計學意義(P<0.01).

2.3細胞凋亡形態學變化ASODN反義復合物聯合槲皮素組凋亡細胞數量明顯較空白對照組、等量脂質體LipofectamineTM2000對照組、SODN復合物組、ASODN復合物組及槲皮素組增加，活細胞核呈黃綠色熒光，胞質成紅色熒光.凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體等典型改變(圖1).

2.4MTT法檢測SSMC7721細胞增殖變化ASODN復合物組（28.4%）或槲皮素組（43.1%）可抑SSMC7721細胞增殖(P<0.01)，而脂質體組（1.7%）則無此效，ASODN反義復合物聯合槲皮素時表現出協同抑制細胞增殖作用（69.8%），兩藥聯合對細胞的增殖抑制效果高于單用ASODN復合物組（28.4%，P<0.01)和槲皮素組(43.1%，P<0.01).

2.5細胞凋亡率的變化與空白對照組、脂質體對照組相比，ASODN復合物組、槲皮素組、ASODN復合物+槲皮素組均能誘導細胞凋亡，且其誘導細胞凋亡率(Annevix(+)PI(-))分別是脂質體組的3.1倍、4.3倍、18.2倍，差異有統計學意義(P<0.01)，ASODN復合物聯合槲皮素組與ASODN復合物組、槲皮素組比較，其誘導細胞凋亡率分別是他們的5.9倍、4.2倍，差異有統計學意義(P<0.01)，并且各組間流式細胞儀檢測時損傷率(Annexin(+)PI(+))無統計學意義（表1）.表1各組細胞凋亡率變化

3討論

Survivin的組織分布特征具有明顯的選擇性，其表達于胚胎和發育

的胎兒組織，但不見于終末分化的成人組織(胸腺、生殖腺除外)，而表達于大多數腫瘤組織中［8-9］，使它成為一個癌的分子標志和治療靶點.研究發現，Survivin能夠通過桿狀病毒IAP重復序列(BIR)作用于Caspase3,Caspase7來抑制凋亡蛋白酶活性，阻止多種凋亡信號誘導的細胞凋亡，而且能在細胞有絲分裂前期通過與紡錘體微管發生特異性結合反應，使腫瘤細胞逃避細胞周期G2/M期檢測點的監控，抵抗因DNA損傷或突變自身誘導的細胞凋亡，從而導致腫瘤細胞異常分裂增殖［10］，另外Survivin蛋白亦可通過p21蛋白間接抑制caspase酶而起作用,阻斷細胞的凋亡過程,其抑制細胞凋亡的作用遠遠大于bcl2家族成員,是迄今發現的最強的凋亡抑制因子.Survivin的高表達可以使腫瘤細胞免受各種凋亡信號的刺激而幫助細胞存活［11-12］.槲皮素(Quercetin)是具有多種生物活性的黃酮類化合物，其維生素P樣的作用已應用于臨床.國內外已有研究顯示，槲皮素是目前已知的最強的抗癌劑之一，能夠誘導多種腫瘤細胞凋亡［13］，同時槲皮素還有抗炎、抗過敏、抗氧化、降血脂、降壓等生理活性.本實驗應用反義核酸技術，用脂質體LipofectamineTM2000介導人工合成的特定DN段ASODN分子轉染SSMC7721細胞，人工合成的特定DN段ASODN分子與進入細胞質的survivinmRNA上的特定位點相結合，形成DNARNA復合物，抑制survivinmRNA與核糖體結合，同時激活RNA降解酶H，降解survivinmRNA，從而抑制或封閉基因的表達，干擾survivin致病蛋白的產生［14］.實驗結果顯示，ASODN復合物作用于肝癌SSMC7721細胞48h后，采用RTPCR和細胞免疫組化檢測示與空白對照組比較，ASODN復合物組survivinmRNA、Survivin蛋白表達明顯下調，而等量脂質體組、SODN復合物組survivinmRNA、Survivin蛋白表達變化差異則無統計學意義，實驗證明了ASODN復合物可有效抑制survivin基因的表達.實驗進一步用等劑量的槲皮素(亞致死濃度)處理實驗Ⅰ部分各實驗組肝癌SSMC7721細胞24h后，實驗結果顯示，與其它組比較，ASODN復合物+40μmol/L槲皮素組(聯合組)AO染色法觀察在相同條件聯合組滿視野見典型細胞凋亡形態學變化且凋亡細胞數量明顯增加，MTT法、AnnexinV/PI雙染流式細胞儀檢測示在同等條件聯合組細胞生長抑制率和細胞凋亡率明顯高于其它組，差異有統計學意義.也就是有效封閉肝癌SSMC7721細胞survivin基因的表達能增強槲皮素對該細胞的增殖抑制和誘導凋亡作用即ASODN反義復合物聯合槲皮素對肝癌SSMC7721細胞的增殖抑制和誘導凋亡作用具有協同效應.實驗結果還表明，SSMC7721細胞survivin基因表達降低后，其抗凋亡能力被有效抑制了，推測聯合組對肝癌細胞的協同細胞毒性導致的凋亡可能是通過兩個凋亡途徑的共同通路［15］即激活Caspase效應子而實現的.至于是通過死亡受體途徑還是通過線立體途徑介導的凋亡有待進一步研究.

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