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1器材與方法
1.1動物與分組選用體重45～50g，鼠齡22d的未成年Wistar雌鼠（清潔級）20只，由河北醫科大學實驗動物中心提供，隨機分為實驗組和生理鹽水對照組兩組。
1.2試劑與儀器一抗VEGF和IL-6兔抗IgG多克隆抗體、購于santacruze公司，SP9001試劑盒及DAB顯色劑購于北京中山生物技術有限公司。LEICARM2125石蠟切片機（萊卡上海分公司），Nikon尼康光鏡顯微照相機（日本株式會社尼康），Motic6.0數碼醫學圖象分析系統（廈門麥克奧迪儀器儀表有限公司）。
1.3OHSS大鼠模型的建立按改良的Ujioka方法［1］在未成年鼠體內建立OHSS模型。每只大鼠從第22日齡起連續4d皮下注射含有10IU妊娠雌馬血清促性腺激素(pregnancymareserumgonadotropin,PMSG,天津實驗動物中心)的生理鹽水0.2ml,第5天(最后一次注射PMSG后24h)注射含有100IUHCG(麗珠制藥廠)的生理鹽水0.2ml。48h后卵巢顯著增大,表面紫褐色,有多個卵泡形成,出現腹水表明建立了大鼠OHSS模型。對照組同期皮下注射等量生理鹽水。
1.4標本采集和貯存HCG注射72h后即29d齡時，肌肉注射氯氨酮（0.1mg/kg）麻醉大鼠，尾靜脈注射1%的EvansBlue(EB,Sigma)0.1ml。30min后從大鼠眼眶采血1ml入抗凝管，離心（3000r/min，10min）取血漿-20℃保存備檢。另采血1ml于試管中，待血液標本凝固后，離心（3000r/min，10min）吸取血清-20℃保存備檢。脫頸處死大鼠。正中切開腹腔，觀察有無腹水,然后按照Ujioka［2］和Khanna［3］的改良方法用5ml生理鹽水沖洗腹腔。將沖洗液收集到試管中,稀釋至10ml,加0.1mol/L氫氧化鈉0.05ml過濾,并以3000r/min的速度在室溫下離心10min。然后用分光光度計(國產721型)在波長590nm測定OD值。隨后取出雙側卵巢組織，用生理鹽水清洗干凈。用4%多聚甲醛固定24h后,常規石蠟包埋,5～7μm連續切片,用于免疫組化染色。
1.5觀察指標
1.5.1腹腔毛細血管通透性根據標準濃度及其OD值繪制標準曲線,算出腹腔沖洗液EB的含量。
1.5.2VEGF和IL-6蛋白質水平測定采用酶聯免疫吸附試驗法（ELISA）。大鼠外周血清VEGF測定定量試劑盒由深圳晶美生物工程有限公司提供，靈敏度為3pg/ml，板內板間變異系數均<9.5%。血漿IL-6定量試劑盒購自上海雄森科技實業有限公司,檢測方法按照說明書進行。每個樣品均設2個復孔,重復3次試驗,結果用MK2型酶標儀讀取吸光值，繪標準曲線求相應值（pg/ml）。
1.5.3VEGF和IL-6蛋白質免疫組化染色采用SP法。一抗VEGF和IL-6兔抗IgG多克隆抗體購于santacruze公司，SP9001試劑盒及DAB顯色劑購于北京中山生物技術有限公司，具體操作過程按說明書進行,DAB顯色,蘇木素復染。每組試驗重復至少3次。用PBS代替一抗作為陰性對照。
1.5.4免疫組化結果判斷光鏡下觀察和圖像分析,VEGF定位于黃體細胞,胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性細胞。Il-6在卵巢和子宮內膜均有表達。選用同批染色切片,每張切片隨機選取5個視野(200×),Nikon尼康光鏡顯微照相機采樣，圖像掃存后Motic6.0數碼醫學圖象分析系統測定平均光密度進行分析。
1.6卵巢過度刺激綜合征診斷標準根據Golan［4］標準,卵巢體積增大、腹腔毛細血管的通透性增加和腹水均出現方可診斷為卵巢過度刺激綜合征。
1.7統計學處理統計方法所有計量資料采用±s表示,均數差異的顯著性采用SPSS統計軟件進行方差分析,P<0.05表示在統計學上有顯著性差異。
2結果
2.1OHSS大鼠腹水EB含量的變化OHSS大鼠腹腔EB含量卵巢過度刺激組腹腔EB含量顯著高于對照組，在統計學上有顯著性差異（P<0.05）。見表1。
2.2OHSS大鼠血中VEGF和IL-6的改變OHSS大鼠血中VEGF和IL-6含量顯著高于對照組，在統計學上有顯著性差異（P<0.05），見表2。
表1OHSS對大鼠腹腔EB含量的影響（略）
與對照組比較,*P<0.05;n=10
表2OHSS大鼠血中VEGF和IL-6的改變（略）
與對照組比較,*P<0.05；n=10
2.3OHSS大鼠卵巢和子宮中VEGF和IL-6的改變大鼠卵巢和子宮切片經免疫組化染色光鏡下觀察，實驗組VEGF在卵巢黃體、子宮內膜和腺體上皮均有表達，IL-6在卵巢黃體和子宮內膜均有表達，免疫組化染色陽性細胞較對照組表達較強，經Motic6.0數碼醫學圖象分析系統分析光密度較對照組在統計學上有顯著性差異（P<0.05）。見表3。
表3OHSS大鼠卵巢和子宮中VEGF和IL-6的免疫組化光密度值（略）
與對照組比較,*P<0.05；n=10
3討論
OHSS是一種醫源性疾病,是指促性腺激素HMG/HCG誘發排卵而引起的證候群,嚴重的OHSS甚可危及生命。由于近30年來生殖內分泌研究進展甚速,助孕技術在臨床上被廣泛應用,藥物誘發排卵、超排卵引起OHSS發生率亦有所上升,如何有效地控制疾病的發展、同時提高患者受孕率成為新的課題。近來研究表明,VEGF是一種特異性地作用于血管內皮細胞的多功能細胞因子,具有增加微血管與小靜脈通透性、促進血管內皮細胞分裂、增殖等作用［5］。
本研究通過在未成年鼠體內建立OHSS模型,此時卵巢顯著增大,表面紫褐色,有多個卵泡形成,有腹水形成,表明成功建立了OHSS模型。本研究顯示，實驗組血中VEGF和IL-6含量增高，VEGF和IL-6在卵巢和子宮內膜均有表達，較對照組在統計學上有顯著性差異。表明在OHSS中,無論是多個卵泡發育和卵子的成熟,排卵后黃體的生成等,均可能導致卵巢和子宮產生和分泌大量的VEGF和IL-6，從而產生局部和全身相關的病理改變，但其發病的具體機理目前尚未明了,有待于進一步研究，從而為臨床上進一步治療OHSS奠定實驗學基礎。