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1材料與方法
1.1材料姜黃素（Curcumin,CUR），羅丹明－123（Rhodamine-123，R-123）及MTT均為Sigma公司產(chǎn)品。鹽酸阿霉素（Adriamycin，ADR）為深圳萬樂藥業(yè)公司產(chǎn)品。DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品。膀胱移行細(xì)胞癌株BIU-87，由北京醫(yī)科大學(xué)泌尿外科研究所饋贈；耐藥株BIU-87/ADR系由本實驗室通過采用遞增阿霉素劑量的方式誘導(dǎo)建立的呈典型MDR表型的耐藥細(xì)胞亞株。高表達(dá)P-gp。細(xì)胞在含0.5mg·L-1濃度的阿霉素、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中以37℃，5%CO2條件培養(yǎng)，實驗前2d換無藥培養(yǎng)基培養(yǎng)。
1.2方法
1.2.1MTT實驗將處于對數(shù)生長期的兩種細(xì)胞分別以2×104/ml濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔終體積200μl。上述條件下培養(yǎng)24h，小心吸盡每孔培養(yǎng)液。實驗組Ⅰ分別加入不同濃度的阿霉素、實驗組Ⅱ分別加入不同濃度的阿霉素加姜黃素（以終濃度0.1%DMSO助溶）。阿霉素終濃度分別為0.05，0.1，0.25，1.5，5(μg/ml)，姜黃素終濃度為25μmol·L-1。對照組Ⅰ為不加細(xì)胞僅含培養(yǎng)液的空白對照，對照組Ⅱ為不加藥物僅加細(xì)胞的陰性對照，以上述條件培養(yǎng)48h后，每孔加MTT(5mg/ml)液20μl，37℃繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄上清液，每孔加150μlDMSO，振蕩10min使結(jié)晶物充分溶解。由空白孔調(diào)零后，以酶標(biāo)儀檢測490nm處的光吸收值(A)。
細(xì)胞存活率(IC)=實驗組平均A值/陰性對照組平均A值
逆轉(zhuǎn)指數(shù)(RI)=IC50(BIU-87/ADR+ADR)/IC50(BIU-87/ADR+ADR+CUR)
1.2.2羅丹明外排實驗羅丹明作為P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的轉(zhuǎn)運底物能較好的代表其轉(zhuǎn)運功能［1,2］。將處于指數(shù)生長期的BIU-87/ADR細(xì)胞以2×104/ml接種于24孔培養(yǎng)板，每孔終體積1ml。上述條件下培養(yǎng)24h。小心吸棄培養(yǎng)液，加入羅丹明至終濃度為5μg·ml-1，上述條件繼續(xù)培養(yǎng)30min，吸棄培養(yǎng)液，加入不含羅丹明的培養(yǎng)液。實驗組Ⅰ僅含培養(yǎng)液和細(xì)胞，實驗組Ⅱ在Ⅰ的基礎(chǔ)上加入姜黃素至終濃度為25μmol·l-1，對照組為含細(xì)胞不加藥液組。分別于0，0.5，1.0，2.0h收獲細(xì)胞。細(xì)胞收獲方法為：吸棄培養(yǎng)液、0.25%胰酶消化、冷PBS(0℃)吹洗、離心(800r/min)3次后，500μl冷PBS吹散細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上檢測(激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長540～660nm)，以熒光強度平均值（Mean）表示細(xì)胞內(nèi)羅丹明濃度。細(xì)胞內(nèi)羅丹明濃度以下式計算：A=實驗組平均熒光強度值-對照組平均熒光強度值。
1.2.3統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果取3次實驗的均值，標(biāo)準(zhǔn)差均小于5%，組間顯著性差異用t檢驗。
2結(jié)果
2.1MTT試驗預(yù)試驗以姜黃素最高濃度25μmol·L-1作用兩細(xì)胞株48h，細(xì)胞存活率均在95%以上，排除了對細(xì)胞的毒性作用（見表1）。結(jié)果表明，姜黃素略增加阿霉素對BIU-87的細(xì)胞毒性作用(P＞0.05)；而對于BIU-87/ADR，姜黃素明顯增加阿霉素細(xì)胞毒性(P＜0.05)，逆轉(zhuǎn)指數(shù)為4.0。
表1細(xì)胞毒分析IC50（略）
*P＞0.05，**P＜0.01
2.2細(xì)胞內(nèi)羅丹明濃度圖1為不同時間段細(xì)胞內(nèi)羅丹明濃度的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。可以看出，在每一時間點，姜黃素組R-123濃度均顯著高于無姜黃素組。姜黃素明顯抑制了細(xì)胞內(nèi)R-123的外排(P<0.05)。
圖1R-123外排實驗（略）
3討論
盡管生物技術(shù)飛速發(fā)展，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在世界的許多地方仍發(fā)揮著極其重要的作用。姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種酚類色素。姜黃素及其類似物和揮發(fā)油是姜黃主要活性成分，具有抗炎、抗菌、保肝、治療創(chuàng)傷、抗癌、抗病毒等活性。其抗腫瘤作用及機制正受到日益重視。
有文獻(xiàn)表明，姜黃素對人類惡性腫瘤細(xì)胞有誘導(dǎo)分化和增殖抑制作用［3，4］，近年研究表明，姜黃素可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［5，6］，并且與阿霉素、絲裂霉素具有協(xié)同作用［7～9］；有人認(rèn)為其具有化療增敏作用［10］。本實驗結(jié)果顯示，姜黃素可以有效逆轉(zhuǎn)膀胱腫瘤的MDR，姜黃素組BIU-87/ADR對阿霉素的敏感性是無姜黃素組的4倍。P-gp具有ATP依賴的生物膜泵功能，能將胞內(nèi)藥物泵至胞外而產(chǎn)生MDR，R-123外排實驗結(jié)果提示，姜黃素直接抑制P-gp的外泵功能為其機制之一。諸多研究顯示，P-gp既可以單獨介導(dǎo)，亦可以參與介導(dǎo)膀胱腫瘤的MDR，是膀胱癌產(chǎn)生MDR的重要機制。由于膀胱癌是人類常見惡性腫瘤之一，具有易復(fù)發(fā)和產(chǎn)生MDR的特性，因此尋找其逆轉(zhuǎn)劑具有重要意義。維拉帕米、環(huán)孢素A等逆轉(zhuǎn)膀胱腫瘤的MDR已有多篇報道［11］，但未見關(guān)于植物藥的研究，我們的實驗無疑為逆轉(zhuǎn)膀胱癌MDR提供了一種新的方法。前述研究表明姜黃素發(fā)揮抑瘤效應(yīng)需要較高濃度，系統(tǒng)用藥難以保持持續(xù)高濃度，膀胱癌術(shù)后，膀胱灌注化療是重要的治療手段，由于系局部用藥，因而具有較大的可行性。