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1材料
1.1動物SPF級SD大鼠，雌雄各半，體重（200±20）g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，普通大鼠飼料喂養(yǎng)。
1.2藥物姜黃素（Curcumin）、大黃素（Emodin），均購自陜西旭煌植物科技有限公司，經(jīng)HPLC檢測純度達(dá)90%以上，使用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成不同濃度的混懸液。水飛薊素（Silymarin，利加隆140膠囊），德國馬博士大藥廠生產(chǎn)，臨用時(shí)用蒸餾水配成2.4mg/ml的供試品液。
1.3試劑DMN購自日本株式會社，使用前用生理鹽水配成0.5%溶液備用。HA，LN，PCIII由北京北方生物技術(shù)研究所提供；TNF-α測試盒由北方生物試劑研究所提供；SOD，MDA，Hyp，考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。甲醛、蘇木素、伊紅、酸性品紅、戊二醛等。
1.4儀器7060型全自動生化分析儀、SN-695B型放免γ測量儀，上海原子核研究所日環(huán)儀器廠。UV-754型分光光度計(jì)，BX50顯微鏡，Olympus公司，2035石蠟切片機(jī)，德國Walldorf公司；E990數(shù)碼攝像機(jī)，Nikon公司。
2方法
2.1分組、造模及給藥隨機(jī)取SD大鼠8只為正常對照組。其它大鼠進(jìn)行造模。將1mlDMN原液溶于200ml生理鹽水中，配制0.5%DMN溶液，避光保存，2周內(nèi)使用。參照文獻(xiàn)［2］給藥，每只大鼠給予0.5%DMN（2ml/kg）腹腔注射，第1周前3d連續(xù)給2/3藥量，后4d不給藥，第2周開始前3d連續(xù)給全藥量，后4天不給藥，持續(xù)4周。正常對照組則給予相同量的生理鹽水腹腔注射。造模結(jié)束后，將存活的大鼠隨機(jī)分為6組，分別為模型對照組、水飛薊素組、姜黃素高、低劑量組和姜大聯(lián)用高、低劑量組,每組8只。正常對照組和模型對照組灌胃蒸餾水，水飛薊素組用藥量分別為人臨床劑量的5倍，即0.024g/kg，姜黃素給藥劑量為100mg/kg和200mg/kg，姜大聯(lián)用劑量分別為50，10和100，20mg/kg。灌胃1次/d，每周灌6d。治療4周后，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。眼眶采血，分離血清，留取肝左葉固定。
2.2觀察指標(biāo)及方法①觀察大鼠一般狀態(tài)包括：飲食變化、行為及毛發(fā)改變等；②全自動生化分析儀檢測大鼠血清ALT，AST，TP，ALB，A/G；③放免法檢測HA，LN，PCIII，TNF-α含量；④肝組織標(biāo)本HE和VG膠原染色，光鏡觀察；⑤α-SMA免疫組化染色：常規(guī)SABC法染色，DAB顯色。
2.3肝膠原增生程度、肝纖維化分級采用Ishak法［3］0級：無肝纖維化；1級：纖維組織向部分匯管區(qū)擴(kuò)大，伴有小纖維間隔；2級：纖維組織向大部分匯管區(qū)擴(kuò)大，并伴有小纖維間隔；3級：纖維組織向匯管區(qū)擴(kuò)大，并伴匯管區(qū)與匯管區(qū)橋接；4級：纖維組織向匯管區(qū)延伸，并有明顯的匯管區(qū)與匯管區(qū)、匯管區(qū)與中央小葉區(qū)橋接；5級：纖維形成明顯的匯管區(qū)與匯管區(qū)、匯管區(qū)與中央小葉區(qū)橋接，間或有假小葉形成；6級：肝內(nèi)布滿小圓形假小葉，假小葉內(nèi)有粗大增生的膠原纖維（肝硬化）。
2.4統(tǒng)計(jì)方法計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s表示，采用F檢驗(yàn)，兩兩比較用q檢驗(yàn)，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0進(jìn)行分析；計(jì)數(shù)資料采用Ridit分析。
3結(jié)果
3.1姜黃素、姜大聯(lián)用對大鼠一般情況的影響正常對照組大鼠生長狀態(tài)良好，體重增加顯著，皮毛光滑，二便如常；大鼠注射DMN后，活動少，精神萎靡，喜睡少動，體重不增加甚至較前下降，尿黃，有腹瀉，大鼠發(fā)生腹水產(chǎn)生率達(dá)70%。經(jīng)姜黃素、姜大聯(lián)用治療后大鼠一般狀態(tài)明顯好于模型組，腹水的發(fā)生率明顯降低。
3.2姜黃素、姜大聯(lián)用對肝纖維化大鼠血清ALT，AST，TP，ALB，A/G的影響結(jié)果如表1。
從表1可以看出，經(jīng)DMN造模后，大鼠血清中ALT、AST的含量升高，TP，ALB，A/G的含量明顯下降，與正常對照組比較均差異顯著（P<0.01）；經(jīng)姜黃素、姜大聯(lián)用治療后，各組大鼠血清中ALT及AST的水平有不同程度降低，TP、ALB、A/G均有升高，與模型組比較有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），且存在一定的量-效關(guān)系。
3.3姜黃素、姜大聯(lián)用對肝纖維化大鼠血清PCIII，HA及LN，TNF-α含量的影響結(jié)果見表2。
表1姜黃素、姜大聯(lián)用對肝纖維化大鼠血清ALT，AST，TP，ALB及A/G的影響（略）
與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，ΔP<0.05,ΔΔP<0.01；n=8
表2姜黃素、姜大聯(lián)用對大鼠血清PCIII，HA，LN，TNF-α含量的影響（略）
與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，ΔP<0.05,ΔΔP<0.01；n=8
從表2可以看出，使用DMN造模后，各組大鼠血清中HA，LN，PCIII，TNF-α含量明顯升高，與正常對照組比較有顯著性差異（P<0.01）；經(jīng)姜黃素、姜大聯(lián)用治療后，大鼠血清中HA，LN，PCIII，TNF-α明顯降低，與模型組比較，差異顯著（P<0.05或P<0.01）。
3.4姜黃素、姜大聯(lián)用對大鼠肝組織SOD，MDA，Hyp含量的影響結(jié)果見表3。
表3姜黃素、姜大聯(lián)用對大鼠肝組織SOD，MDA，Hyp含量的影響（略）
與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，ΔP<0.05,ΔΔP<0.01；n=8
從表3看出，DMN造模后，各組大鼠肝組織中MDA及Hyp的含量明顯升高，SOD的含量降低，與正常對照組比較有顯著性差異（P<0.01）；經(jīng)姜黃素、姜大聯(lián)用治療后，各治療組大鼠肝臟組織中MDA、Hyp的含量降低明顯，SOD含量上升，與模型組比較差異顯著（P<0.05或P<0.01）。
3.5病理組織觀察結(jié)果
3.5.1肉眼觀察正常對照組大鼠肝臟呈紅褐色，表面光滑，質(zhì)軟，顏色正常；模型組大鼠肝萎縮，表面較粗糙，色晦暗，部分肝表面有細(xì)小結(jié)節(jié)，質(zhì)硬。姜黃素、姜大聯(lián)用組肝組織略變小，表面欠光滑，質(zhì)地較韌，顏色偏暗，均較模型組為輕。各組大鼠腹水發(fā)生、肝表面顆粒出現(xiàn)情況見表4。
表4姜黃素、姜大聯(lián)用對大鼠腹水、肝臟表面顆粒的影響（略）
從表4可以看出，正常對照組大鼠未見腹水發(fā)生，肝臟表面無顆粒形成，模型組大鼠腹水發(fā)生率達(dá)87.5%，肝表面全部出現(xiàn)顆粒。經(jīng)姜黃素、姜大聯(lián)用干預(yù)后，二者的發(fā)生率均有不同程度的下降。
3.5.2HE染色觀察正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝竇無擴(kuò)張出血，匯管區(qū)及中央靜脈血管壁清晰可見，管壁無增厚，管周無膠原纖維可見；模型組可見肝結(jié)構(gòu)被破壞，肝小葉結(jié)構(gòu)、肝索排列均紊亂，部分肝細(xì)胞腫脹，肝小葉中央?yún)^(qū)明顯壞死，膠原纖維增生顯著，部分形成假小葉；水飛薊素組可見肝小葉樣結(jié)構(gòu)較正常，肝細(xì)胞體積略增大，有少量纖維組織增生，纖維化程度輕于模型組；姜黃素低劑量治療組可見肝組織結(jié)構(gòu)有一定的改善，肝小葉中央?yún)^(qū)可見肝細(xì)胞壞死，匯管區(qū)炎性細(xì)胞部分浸潤，有少量纖維組織增生，未見假小葉形成；姜黃素高劑量治療組肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，炎性反應(yīng)及壞死減輕，纖維組織增生不明顯；姜大聯(lián)用低劑量組肝組織結(jié)構(gòu)改善較明顯，未見肝細(xì)胞壞死，匯管區(qū)炎性細(xì)胞部分浸潤，有少量纖維組織增生；姜大聯(lián)用高劑量治療組肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，纖維組織增生不明顯。
3.5.3VG染色觀察正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，可見極少量膠原纖維主要分布于匯管區(qū)和中央靜脈周圍。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝索排列紊亂，肝小葉被纖維間隔分割，形成大小不等的假小葉，由膠原纖維構(gòu)成的纖