順鉑聯(lián)合姜黃素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡研究范文

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摘要

目的：研究應(yīng)用順鉑聯(lián)合姜黃素對誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞HGC27凋亡的影響及機(jī)制。方法：用CCK8法檢測單獨或聯(lián)合使用不同劑量順鉑或/和姜黃素對胃癌細(xì)胞HGC27增殖的影響；用Hochest33258染色檢測聯(lián)合應(yīng)用順鉑和姜黃素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞HGC27凋亡的發(fā)生率。用Westernblot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)分子PARP1蛋白剪切體和DNA損傷蛋白p-γH2AX的表達(dá)變化。結(jié)果：單用順鉑可以呈劑量依賴性地促進(jìn)HGC27細(xì)胞凋亡。5μmol•L-1姜黃素對HGC27細(xì)胞增殖無明顯作用，10μmol•L-1姜黃素反而輕微促進(jìn)HGC27細(xì)胞增殖。20、40、80μmol•L-1姜黃素對HGC27細(xì)胞的增殖抑制率分別為10.97%、15.15%、32.93%。分析聯(lián)合用藥組：5μmol•L-1姜黃素聯(lián)合順鉑組反而促進(jìn)HGC27細(xì)胞生長；10μmol•L-1姜黃素聯(lián)合不同劑量順鉑和單用順鉑組比較，組間抑制率沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。20μmol•L-1姜黃素聯(lián)合4、6μmol•L-1順鉑有明顯的促進(jìn)細(xì)胞的凋亡作用,抑制率分別為70.68%、87.30%。Hochest33258染色結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡小體和壞死細(xì)胞明顯增多。Westernblot結(jié)果顯示，在聯(lián)合用藥組HGC27細(xì)胞PARP1剪切體蛋白和p-γH2AX蛋白表達(dá)明顯增加。結(jié)論：順鉑聯(lián)合姜黃素可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞HGC27的凋亡，機(jī)制是姜黃素可以加重順鉑引起的細(xì)胞DNA雙鏈損傷。

關(guān)鍵詞

順鉑；姜黃素；細(xì)胞凋亡；p-γH2AX

自從Rosenberg等[1]發(fā)現(xiàn)順鉑的抗腫瘤活性后，鉑類藥物的研究得到迅速發(fā)展。鉑類藥物已被廣泛應(yīng)用于各種惡性腫瘤的臨床治療中。據(jù)統(tǒng)計，目前臨床化療或者聯(lián)合化療治療惡性腫瘤的方案中有70%~80%應(yīng)用到鉑類藥物。由于鉑類藥物在治療過程中伴發(fā)嚴(yán)重的胃腸反應(yīng)、腎毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性和耐藥性等[2]，因此，如何減弱該類藥物的毒副作用和增加其化療敏感性日益受到關(guān)注。姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種植物多酚。姜黃素的抗腫瘤作用為多靶點，因而日益引起重視。姜黃素對消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)的多種腫瘤等均具有一定程度的抑制作用[3]。化療藥物增敏方面，聯(lián)合使用順鉑和姜黃素已用于肝癌[4]、肺癌[5]、卵巢癌[6]等研究。目前，對于順鉑聯(lián)合姜黃素是否可以直接通過引起DNA雙鏈損傷的加重而誘導(dǎo)胃癌HGC27細(xì)胞凋亡尚未見報道。本實驗通過聯(lián)合用藥直接觀察雙鏈損傷的指標(biāo)p-γH2AX和凋亡相關(guān)標(biāo)志物PARP1蛋白剪切體的變化，初步探討這兩種藥物聯(lián)合作用誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞HGC27凋亡的作用機(jī)制。

1材料

1.1細(xì)胞來源及培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞HGC27購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。細(xì)胞培養(yǎng)于含100μg•mL-1鏈霉素、100U•mL-1青霉素和10%胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2試藥與儀器RMPI1640培養(yǎng)基（Invitrogen，美國）；胎牛血清（四季青，杭州）；青霉素（山東新華魯抗，批號20141007）；鏈霉素（華北制藥，批號F31121126）；順鉑注射液（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，諾欣TM，批號140302）；姜黃素（Turmeric，原植物Curcumalon-ga，Sigma公司）；BCA（BicinchoninicAcidproteinsaykit）蛋白濃度測定試劑盒、熒光染料Hochest33258試劑盒、RIPA裂解液[50mmol•L-1Tris（pH7.4），150mmol•L-1NaCl，1%TritonX-100，0.1%十二烷基磺酸鈉，1%去氧膽酸鈉]；裂液、單克隆抗α-tubulin抗體、抗熒光淬滅劑（南通碧云天生物技術(shù)有限公司）；CCK-8（CellCountingKit-8）試劑盒（上海同仁化學(xué)有限公司）；抗PARP1抗體、抗p-γH2AX抗體（美國Abcam公司）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液（Enhancedchemi-luminescence，ECL，美國Millipore公司）；其它生化試劑均為國產(chǎn)分析純。CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；IX-70倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；垂直電泳儀；半干式電轉(zhuǎn)移裝置（美國Bio-Rad公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio-TEKInstruments公司）。

2方法

2.1CCK-8法檢測順鉑和姜黃素抑制胃癌細(xì)胞HGC27增殖培養(yǎng)HGC27細(xì)胞：在96孔板中每孔接種5000個細(xì)胞。對細(xì)胞進(jìn)行分組處理：單用順鉑組（0、2、4、6、8μmol•L-1）、單用姜黃素組（0、5、10、20、40、80μmol•L-1）、順鉑聯(lián)合姜黃素組，即2、4、6、8μmol•L-1順鉑分別聯(lián)合5、10、20μmol•L-1姜黃素，以上各組處理細(xì)胞24h，每孔加入CCK-8試劑10μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1.5h，在酶標(biāo)儀上450nm檢測吸光度A450nm。每組設(shè)3平行實驗。計算藥物（或藥物組合）對細(xì)胞增殖的抑制率。

2.2Hochest33258染色法檢測順鉑聯(lián)合姜黃素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞HGC27凋亡在6孔板中接種HGC27細(xì)胞，待細(xì)胞培養(yǎng)至80%滿6孔板孔底。分別設(shè)4組：對照組、單用4μmol•L-1順鉑組、單用20μmol•L-1姜黃素組、4μmol•L-1順鉑聯(lián)合20μmol•L-1姜黃素用藥組。處理HGC27細(xì)胞24h，去培養(yǎng)液，用甲醇室溫固定30min。每孔加入Hochest33258染色液50μL。避光染色30min后，應(yīng)用磷酸鹽緩沖液（PBS）液洗滌3遍，加入抗熒光淬滅劑20μL，立即在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中凋亡小體的情況。

2.3免疫印跡法檢測HGC27細(xì)胞凋亡相關(guān)分子的變化在培養(yǎng)的HGC27細(xì)胞，按照“2.2”方法分別設(shè)立對照組和處理組，處理細(xì)胞24h。用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，4℃、12000r•min-1離心10min，取上清液，運(yùn)用BCA法測定蛋白濃度。灌制12.5%分離膠的SDS-PAGE。分別按照60μg/孔的上樣量，加入全蛋白，經(jīng)90V穩(wěn)壓電泳后，運(yùn)用200mA恒流半干式電轉(zhuǎn)移1h，5%脫脂奶粉室溫封閉膜1h，PBST液洗滌3次，孵育抗體按照α-tubulin（1∶1000）、PARP1（1∶1000）；p-γH2AX（1∶500）稀釋，4℃孵育過夜，PBST液洗滌；加入1∶1000稀釋的辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記二抗，37℃孵育1h，PBST液洗滌。ECL化學(xué)發(fā)光液曝光、檢測。進(jìn)行灰度值比較（相對灰度值=處理組灰度值/對照組）。

2.4統(tǒng)計學(xué)處理運(yùn)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間樣本均數(shù)間采用多因數(shù)方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1順鉑和姜黃素對HGC27細(xì)胞增殖的抑制作用

3.1.1順鉑和姜黃素單獨作用結(jié)果預(yù)實驗分別考察4種不同濃度順鉑和5種不同濃度姜黃素組對HGC27細(xì)胞的抑制作用，由表1可見，2、4、6、8μmol•L-1順鉑可以呈劑量依賴性的抑制細(xì)胞增殖。5μmol•L-1姜黃素對HGC27細(xì)胞增殖無明顯影響；10μmol•L-1姜黃素對HGC27細(xì)胞增殖反而略有促進(jìn)作用；20、40、80μmol•L-1姜黃素可以不同程度地抑制HGC27細(xì)胞增殖。其中20、40μmol•L-1姜黃素組間沒有差異；80μmol•L-1姜黃素有明顯抑制HGC27細(xì)胞增殖的作用（見表1）。

3.1.2順鉑聯(lián)合姜黃素對HGC27細(xì)胞增殖的影響聯(lián)合用藥結(jié)果（見表2）顯示：2、4、6μmol•L-1順鉑和5μmol•L-1的姜黃素聯(lián)合應(yīng)用對HGC27細(xì)胞增殖的抑制率分別為17.64%、36.90%、66.29%。單用2、4、6μmol•L-1順鉑對HGC27細(xì)胞抑制率分別是34.09%、46.18%、71.55%。提示5μmol•L-1的姜黃素和順鉑聯(lián)用反而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。2、4、6、8μmol•L-1順鉑聯(lián)合10μmol•L-1的姜黃素作用時，誘導(dǎo)HGC27細(xì)胞凋亡率分別為32.32%、49.00%、72.80%、86.21%，與單用順鉑組細(xì)胞凋亡率34.09%、46.18%、71.55%、86.21%相接近，兩組間抑制率沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。當(dāng)4、6μmol•L-1的順鉑聯(lián)合20μmol•L-1的姜黃素作用時，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率為70.68%、87.30%，顯著高于單用順鉑的凋亡率，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（見表2）。

3.2順鉑聯(lián)合姜黃素對HGC27細(xì)胞凋亡的影響聯(lián)合用藥作用于HGC27細(xì)胞24h后，經(jīng)Hochest33258染色，并計數(shù)500個細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的個數(shù)，折算凋亡率（每組3平行）。結(jié)果顯示，單用順鉑可以引起細(xì)胞凋亡（圖1-B），其凋亡率為23.2%；20μmol•L-1姜黃素可以誘導(dǎo)少量細(xì)胞凋亡（圖1-C），凋亡率為5.71%；聯(lián)合應(yīng)用順鉑和姜黃素作用于HGC27細(xì)胞組發(fā)生的凋亡最明顯（圖1-D），其凋亡率為35.60%，顯著高于單用順鉑組和單用姜黃素處理組（圖2）（P<0.05）。

3.3免疫印跡法檢測HGC27細(xì)胞在凋亡過程中相關(guān)因子的變化運(yùn)用Westernblot法檢測單用4μmol•L-1順鉑、單用20μmol•L-1姜黃素和順鉑聯(lián)合姜黃素作用24h，HGC27細(xì)胞內(nèi)DNA雙鏈損傷分子標(biāo)志物p-γH2AX和凋亡蛋白PARP1剪切體的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，單用4μmol•L-1順鉑和20μmol•L-1姜黃素均可以引起p-γH2AX表達(dá)增加，其相對灰度值分別為：6.70和3.7；聯(lián)合用藥組p-γH2AX表達(dá)增加最明顯，其相對灰度值為8.52。單用順鉑和姜黃素也可以誘導(dǎo)HGC27細(xì)胞中PARP1蛋白的剪切體表達(dá)，其相對灰度值分別為5.32和3.27。聯(lián)合用藥組中，細(xì)胞內(nèi)PARP1蛋白的剪切體表達(dá)增加最明顯，其相對灰度值為6.27。與單用順鉑組比較，聯(lián)合用藥組p-γH2AX和PARP1剪切體均顯著增加（P<0.05），提示姜黃素可促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的HGC27細(xì)胞DNA損傷和凋亡（圖3、圖4）。

4討論

我國胃癌的發(fā)病率占所有惡性腫瘤的第四位，死亡率占第二位。作為一線化療藥物，順鉑被廣泛用于胃癌等實體瘤治療中。順鉑主要通過主動運(yùn)輸形式進(jìn)入細(xì)胞，與DNA嘌呤形成鏈內(nèi)交聯(lián)或鏈間交聯(lián)，導(dǎo)致DNA雙鏈損傷，引發(fā)細(xì)胞凋亡[7]，DNA損傷可激活PARP1蛋白，從而殺傷腫瘤細(xì)胞[7]。但是，應(yīng)用順鉑治療的同時會引發(fā)多種副作用和產(chǎn)生藥物耐藥性。如何降低鉑類藥物的耐藥性，增加機(jī)體藥物敏感性，愈來愈受到人們重視。將中藥提取單體姜黃素聯(lián)合順鉑用于誘導(dǎo)HGC27細(xì)胞DNA損傷和凋亡，結(jié)果顯示，順鉑可以濃度依賴性誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡；而姜黃素只有當(dāng)濃度達(dá)20μmol•L-1時才有誘導(dǎo)HGC27細(xì)胞凋亡的作用。所以，最終選擇4μmol•L-1順鉑和20μmol•L-1姜黃素用于觀察其聯(lián)合作用，其抑制率是單用4μmol•L-1順鉑的1.53倍，明顯提高HGC27增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的效果。DNA雙鏈損傷的早期反應(yīng)是使組蛋白γH2AX蛋白的羧基末端磷酸化，γH2AX蛋白磷酸化的升高，激活凋亡相關(guān)蛋白PARP1的剪切體的表達(dá)，可顯著增加癌細(xì)胞對順鉑等化療藥物的敏感性[8]。磷酸化γH2AX蛋白是DNA雙鏈損傷的效應(yīng)器，其變化可反映DNA雙鏈損傷的程度[9]。本研究顯示，4μmol•L-1順鉑聯(lián)合20μmol•L-1的姜黃素可以引起磷酸化γH2AX表達(dá)明顯上升，PARP1蛋白剪切體表達(dá)增加；聯(lián)合用藥誘導(dǎo)HGC27細(xì)胞的凋亡也相應(yīng)增加。本研究結(jié)果為如何降低順鉑毒副作用、提高順鉑化療藥物的敏感性提供了新的思路。

順鉑聯(lián)合姜黃素作用于HGC27細(xì)胞，可以增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。姜黃素增強(qiáng)順鉑殺傷HGC27細(xì)胞作用的原因可能是姜黃素增強(qiáng)了順鉑和DNA的結(jié)合能力，從而抑制DNA修復(fù)功能[10]，使腫瘤細(xì)胞DNA損傷加重，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。本文對順鉑聯(lián)合姜黃素促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡作用進(jìn)行了初步研究。姜黃素是否能增加其它化療藥物效果或用于逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥細(xì)胞的敏感性和減少化療藥物毒副作用等值得深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1]RosenbergB,VancampL,TroskoJE,etal.Platinumcompounds:anewclsofpotentantitumouragents[J]．Nature,1969,222(5191):385－6．

[2]趙樹泉，梁富程，王曉謙，等.中西醫(yī)對抑制順鉑毒副作用的研究進(jìn)展[J].實用癌癥雜志，2011，26（5）：546-50.

[3]尹川，唐世孝.姜黃素抗胃癌機(jī)制研究進(jìn)展[J].國際消化病雜志，2014，34（1）：39-42.

[4]熊二夢，龔愛華，金潔，等.姜黃素聯(lián)合順鉑對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖自噬和凋亡的影響[J].江蘇醫(yī)藥，2014，40（1）：1-5.

[5]余樂，陳明輝，古春萍，等.順鉑降低銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá)誘導(dǎo)人食管鱗癌細(xì)胞耐藥[J].中國藥理學(xué)通報，2011，27（7）：911-5.

[6]蔡勇，王季穎.姜黃素聯(lián)合順鉑對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549放療增敏作用的初步研究[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2015，20（1）：13-7.

[7]范引俠，王艷華，邢蘭瑛，等.姜黃素聯(lián)合順鉑對人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖的抑制作用[J].西安交通大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版，2012，33（5）：568-71.

[8]Flores-PérezA,RafaelliLE,Ramírez-TorresN,etal.RAD50targetingimpairsDNAdamageresponsesensitizeshumanbretcancercellstocisplatintherapy[J].CancerBiolTher,2014,15(6):777-88.

[9]于林，孫青.磷酸化組蛋白預(yù)測肝癌細(xì)胞對某些化療藥物的敏感性[J].中國腫瘤生物治療雜志，2008，15（1）：61-5.

[10]LiuTY,TanZJ,JiangL,etal.CurcumininducesapoptosisingallbladdercarcinomacelllineGBC-SDcells[J].CancerCellInt,2013,13(1):64.

作者：李愛萍 王強(qiáng) 陳敏娟 周建偉 單位：南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院