涎腺腺樣囊性癌細胞來源微泡研究范文

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［摘要］

目的：通過檢測涎腺腺樣囊性癌來源微泡量與神經生長因子表達量的關系，為進一步探求涎腺腺樣囊性癌復發、轉移、擴散及嗜神經侵襲的機制提供分子生物學的實驗依據。方法：用掃描電鏡觀察微泡分泌量的情況。采用超高速密度梯度離心法分離純化微泡，以WesternBlotting技術檢測其標志性蛋白的表達。結果：神經生長因子的表達和ACC－2微泡的分泌呈正相關性。從ACC－2培養上清中分離出的小泡，透射電鏡下觀察為直徑50－100nm、大小均一、具有明顯異質性的圓形或橢圓形膜性小囊泡，有完整的包膜，內為低電子密度物質；WesternBlot檢測出小泡中含有HSP70和MHC－Ⅰ的表達。結論：涎腺腺樣囊性癌來源微泡可能在其嗜神經侵襲中起著重要作用，且與神經生長因子的表達密切相關。

［關鍵詞］

微泡；腺樣囊性癌；透射電鏡；掃描電鏡

微泡在免疫學領域、尤其腫瘤免疫治療方面逐漸成為研究熱點[1]。微泡是直徑30～100nm的雙層脂質膜包被的扁圓球形小泡，體內多種細胞都能分泌，其生物膜上和內容物中含有大量與其來源和功能密切相關的蛋白、核酸、脂質成分[2]。微泡可從多種體液中分離提取[3]，參與各種生理和病理過程[4]。目前有多種正常細胞和腫瘤細胞來源微泡的報道[5～8]。但對涎腺腺樣囊 性癌細胞來源的微泡尚未見報道。涎腺腺樣囊性癌（salivaryadenoidcysticcarcino－ma，SACC）是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，在涎腺惡性腫瘤中居第2位[9]。其局部侵襲性強，易沿神經鞘膜及組織間隙擴散，邊界不清；易侵入血管，發生血運轉移，轉移率31．66％，是口腔領面部惡性腫瘤中遠處轉移率最高的腫瘤之一[10]。近年來有學者發現NTs及其受體在腺樣囊性癌、前列腺癌、胰腺癌等具有嗜神經侵襲特性腫瘤中呈現特異性高表達，證實神經營養素家族及其受體與腫瘤嗜神經侵襲關系密切[11]。還有報道神經生長因子（nervegrowthfactor，NGF）及其受體是腺樣囊性癌嗜神經侵襲機制的分子生物學基礎之一[12]。此外，研究表明，表達特異性表面受體分子的細胞能分泌更多微泡[6]。由此推測，在培養體系中添加某些相關刺激因子可能會增加腫瘤細胞的微泡分泌。而微泡可能為探索涎腺腺樣囊性癌的發病機理及臨床診斷、治療提供新的思路。故本研究通過探測不同表達量的生長因子及微泡分泌量的關系，為進一步探求涎腺腺樣囊性癌復發、轉移、擴散及嗜神經侵襲的機制提供分子生物學的實驗依據。

一、材料和方法

1材料DMEM培養基（ThermoScientificHyclone，美國）；胎牛血清（上海復蒙基因生物科技有限公司）；NGF－7S（神經生長因子）、K252a（TrkA阻斷劑）、重水、分析純蔗糖（Sigma－Aldrich，美國）；鼠抗人MHC－I單克隆抗體、鼠抗人HSP－70單克隆抗體（Santa，美國）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG結合物（武漢博士德生物技術有限公司）；超高速冷凍離心機（Beckman，美國）、掃描電子顯微鏡S3400＋EDX（Hitachi，日本）；100kDaAmi－con超濾離心管（Millipore，美國）；透射電子顯微鏡（Hitachi，日本）；凝膠成像分析系統（UVP，美國）；細胞株：人涎腺腺樣囊性癌細胞系ACC－2及ACC－M，人舌癌細胞系Tca8113，人皮膚惡性黑色素瘤細胞系A375（上述細胞株均由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室保存）。2細胞培養復蘇細胞ACC－2、ACC－M、Tca8113、A375，棄去上清液，加入lmL培養基重懸，接種至75mm2培養瓶中，加入8mL培養基，放入37℃的CO2培養箱靜置培養，按常規隔日換液，3d傳代1次。待傳代3次開始后續試驗，收集更換的上清液，以備提取微泡用。3掃描電鏡樣品制備：4種細胞培養至對數生長期后，分別用0．25％胰酶消化收集，并作細胞計數，調整細胞密度1×105個／mL，接種50μL細胞懸液到6孔培養板中央（內置蓋玻片），放入培養箱內孵育2h。孵育畢，倒置相差顯微鏡下觀察到細胞開始貼壁，遂加入2mL培養基繼續培養箱靜置培養。次日，按如下分組更換培養液，37℃培養箱靜置培養。（根據產品說明書確定最終工作濃度，NGF－7S：10ng／mL，K252a：100nM。）對照組仍加入DMEM培養液NGF組更換的DMEM培養液中加入NGF－7S使其最終濃度為10ng／mL阻斷組吸除原培養液后，PBS5mL洗2次，加入工作濃度為100nM的K252a1mL，37℃孵育45min，吸除，PBS5mL洗2次，換為DMEM培養液于24h后吸除培養液，PBS液輕洗2次，取出細胞爬片，2．5％戊二醛（0．lmol／LPBSpH＝7．4配制）4℃固定24h。送電鏡中心處理。脫水（用30％～100％濃度梯度乙醇逐級脫水）、臨界點干燥、真空噴金。掃描電鏡下觀察、照相。4微泡提取：按照GMP（GoodManufacturingPractice）標準[16]提取制備微泡樣品（ACC－2MV），用0．22μm濾器過濾除菌，分裝，置于－80℃冰箱保存備用。5鑒定微泡5．1用透射電鏡觀察提取的ACC－2MV。采用負染法處理電鏡樣品，取20μLACC－2MV樣品于載樣銅網上，于室溫靜置1min；用濾紙從側面吸干液體，滴加20g／L磷鎢酸（pH＝6．8）約30μL于銅網上，室溫負染1min；用濾紙吸干負染液，在白熾燈下烤干，于透射電鏡下觀察、照相。5．2用WesternBlotting法檢測微泡標志性蛋白HSP－70和MHC－I在ACC－2MV中的表達。將微泡樣品ACC－2MV和ACC－2細胞裂解物用SDS－PAGE凝膠分離，然后將蛋白轉移到PVDF膜上，室溫封閉后分別用鼠抗人HSP70、MHC－I單抗作為一抗，HRP標記的羊抗鼠抗體為二抗，用ECL化學發光法檢測。6數據分析所有數據均為3次WesternBlot獨立實驗結果，以x±s表示。采用SPSS13．0統計軟件進行統計學分析。采用ANOVA和t檢驗，取P＜0．05有統計學差異。

二、結果

1掃描電鏡結果掃描電鏡下，細胞表面附著多少不等的圓形、大小較均一的小泡。在對照組，4種細胞的微泡分泌均只在個別、少數細胞中觀察到，且細胞表面附著的微泡數目較少；在NGF組，觀察到A375、ACC－2、ACC－M細胞中有微泡分泌細胞數明顯增多，且每個細胞微泡附著量也增多，但Tca8113細胞中有分泌細胞數增加不明顯；在阻斷組，4種細胞微泡分泌均顯著減少，鏡下幾乎看不到有微泡附著的細胞（圖1）。2微泡的鑒定2．1形態學觀察：將ACC－2培養上清中分離出的沉淀，置于透射電鏡下觀察，可見大小均一、具有明顯異質性的圓形或橢圓形膜性小囊泡，染色后可見囊泡中央色淡、周邊濃染，邊緣清晰。直徑50～100nm，有完整的包膜，內為低電子密度物質（圖2）。2．2WesternBlotting法檢測微泡標志性蛋白HSP－70和MHC－I的表達（以beta－actin蛋白為內參）經免疫印跡分析，本實驗從ACC－2培養上清中提取的微泡ACC－2MV中明顯檢測到了微泡標志性蛋白HSP－70和MHC－I的表達（圖3）。UVP分析儀測得各蛋白條帶的灰度值（表1），以目的蛋白的灰度值除以內參蛋白的灰度值校正誤差，所得結果代表樣品的目的蛋白相對含量。結果顯示，和等量的ACC－2細胞裂解物相比，ACC－2微泡ACC－2MV內的HSP－70和MHC－I蛋白含量偏少，有統計學差異（P＜0．05）（表2）。

三、討論

研究發現腺樣囊性癌細胞表達NGF、NT－3及相應受體TrkA、TrkC與嗜神經侵襲相關，而且對ACC嗜神經侵襲起促進作用，而在其它無嗜神經性的惡性腫瘤及多形性腺瘤中均無表達。有研究報道，ACC病理切片中神經束的密度明顯高于正常腮腺組織及腺泡細胞癌，認為ACC分泌神經生長因子刺激神經纖維向ACC腫瘤細胞群內生長。故神經生長因子及相應受體，可作為ACC的生物學標志物。研究發現神經生長因子NT－3可通過TkrC加強雪旺細胞遷移能力，而這一作用可被特異性酪氨酸激酶受體阻斷劑K252a所阻斷。在本實驗中，研究對象惡性黑色素瘤（A375）、腺樣囊性癌（ACC－2、ACC－M）均是有嗜神經侵襲特性的腫瘤，而舌癌（Tca8113）不具備這一特性。掃描電鏡觀察發現，體外培養惡性黑色素瘤細胞、腺樣囊性癌細胞、舌癌細胞均可見微泡分泌，其中腺樣囊性癌細胞、舌癌細胞只有個別細胞分泌微泡，但惡性黑色素瘤細胞有較多細胞分泌且每個細胞附著的微泡數也較多。實驗結果還發現，惡性黑色素瘤和ACC細胞的微泡分泌量受神經生長因子（NGF）的影響，能顯著增加；且神經生長因子受體阻斷劑（K252a）能有效抑制微泡的分泌，間接說明微泡分泌的增加是受NGF影響。而舌癌細胞的微泡分泌不太受神經生長因子影響，也間接說明神經生長因子對嗜神經性腫瘤的作用。由此可假設，腺樣囊性癌周圍的神經組織能分泌神經生長因子及其他相關因子，作用于腫瘤細胞后，其微泡能大量分泌，進而由微泡攜帶腫瘤細胞的相關信息物質與神經組織互相作用。

目前已知微泡可由多種類型細胞分泌，包括血細胞、上皮細胞、神經細胞、腫瘤細胞等。在透射電鏡下可觀察到微泡的特征性形態－－碟狀外形，即由脂質雙分子層包被的扁圓球形。直徑約30～100nm，密度在1．13～1．19g／mL之間。傳統的微泡提取方法多是超高速差速離心和超濾離心法。而我實驗組前期實驗證明通過蔗糖密度梯度離心法提取微泡的量及純度均較佳。目前對微泡的鑒定主要依賴形態學觀察和蛋白組成分析。用透射電鏡觀察微泡形態，用WB鑒定特異性蛋白的表達。本實驗觀察到直徑50～100nm，大小均一、具有明顯異質性的圓形或橢圓形膜性小囊泡，在形態學上與已有報道的微泡特征相符，而與以往研究所呈現出來的差異，考慮是由于實驗中電鏡樣本制備方法之間的差異引起的。此外，本實驗檢測的2種微泡標志性蛋白（MHC－I及HSP－70）均有良好表達，且微泡內的這兩種蛋白含量較細胞內少，其差異性有統計學意義。由此可見，本實驗通過差速離心法及重水蔗糖墊法成功分離提取到了涎腺腺樣囊性癌細胞分泌的微泡。綜上所述，對涎腺腺樣囊性癌來源微泡進行的初步研究，將為涎腺腺樣囊性癌發病機制的研究以及涎腺腺樣囊性癌的臨床治療提供一個新的契機。

作者：張卓遠 嚴超然 李博 李龍江 單位：四川大學華西口腔醫院頭頸腫瘤外科·口腔疾病研究國家重點實驗室