姜黃素對直腸癌放療的作用范文

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《中華中醫(yī)藥學刊雜志》2014年第六期

1實驗方法

1．1細胞培養(yǎng)人直腸癌HR8348細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，并置人37℃、5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2～3d傳代1次，細胞貼壁生長，胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期的細胞用于實驗。

1．2實驗動物飼養(yǎng)BAIB/C荷瘤裸鼠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，飼養(yǎng)條件為超凈生物(SPF)層流架內，保持恒溫(25±2)℃、恒濕(45%～50%)，籠具、墊料、飼料及飲水均經高壓蒸氣滅菌，每日保持10h光照、14h無光的明暗周期。對裸鼠實驗室及飼養(yǎng)環(huán)境定期嚴格紫外線消毒，實驗操作均在無菌罩內進行。

1．3體外實驗①實驗分組將人直腸癌HR8348細胞分為對照組(給予DMSO液);姜黃素組(給予2．5μM姜黃素);照射組(單純X線照射);聯合組(給予2．5μM姜黃素，聯合X線照射)。②細胞毒實驗(MTT法):取指數生長期HR8348細胞制成單細胞懸液，接種于96孔板，每孔200μL，每組細胞接種5個復孔，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，去掉培養(yǎng)液取出，分設4組見上，4h后姜黃素聯合放療組、放療組分別予4Gy、6Gy、10Gy放射線照射(劑量率2．0Gy/min)，繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后將其從培養(yǎng)箱中取出，再加入MTT20μL/孔(濃度為5mg/mL)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱放置4h后終止培養(yǎng);吸棄各培養(yǎng)孔內的上清液，于每孔加入150μL的二甲基亞砜，震蕩搖勻，37℃放置2h，在全自動酶標儀上以波長490nm測各孔吸光度OD值。細胞抑制率IR(%)=(對照組OD值－實驗組OD值)/對照。實驗重復3次。③細胞凋亡檢測:根據以上實驗分組每組4個平行管，待細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，姜黃素組、姜黃素聯合放療組加入姜黃素2．5μΜ，放療組加入等量生理鹽水震蕩混勻，繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。直線加速器常溫下照射(劑量為10Gy，劑量率為2．0Gy/min)，將四組細胞經放射線照射24h和48h后，消化，離心，用490μLPBS重懸，加入5μLAnnexinV－FITC及5μLPI(濃度250μg/mL)，混勻置室溫暗處孵育30min，PBS洗2遍，流式細胞儀上機檢測，AnnexinV/PI標記法檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

1．4體內實驗①動物腫瘤模型的制備:復蘇人直腸癌HR8348細胞，用含l0%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃含5%二氧化碳混合氣體的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取指數生長期的HR8348細胞經胰酶消化分散后，PBS洗滌2次，2000r/min離心5min，重懸于PBS中，制備細胞濃度為2×107/mL，取100μL(2×105個細胞/只)分別接種于裸鼠右后下肢皮下，SPF環(huán)境下飼養(yǎng)，待瘤體直徑約5～8rnrn時進行治療實驗。觀察接種部位液體吸收、腫瘤生長過程及裸鼠狀況。每周用游標卡尺測量瘤體長徑(a)和短徑(b)，待裸鼠皮下移植瘤生長兩周時隨意將裸鼠分組。②實驗分組及治療方法:取BALB/C模型裸鼠64只，5周齡，18～22g，雄性，隨機分為4組，每組16只，各組腫瘤體積無顯著差異。對照組(等量生理鹽水處理)，姜黃素組(接受姜黃素腹腔注射20mg/kg，共1次);照射組(單純給予瘤床放射治療，放療總劑量10Gy，劑量率為2．0Gy/min);聯合組(腹腔注射姜黃素20mg/kg，共1次。同時對小鼠瘤床進行放療總劑量10Gy，劑量率為2．0Gy/min)。③生長延緩測定:自照射之日起每3天測量一次腫瘤的長徑短徑，通過下列公式來計算腫瘤體積:腫瘤體積=(a×b2)/2，a為瘤體的長徑，b為瘤體的短徑。取均值，繪制腫瘤體積變化曲線。裸鼠動物治療結束后拉頸處死，剝離瘤體，每組中取部分瘤組織做快速冰凍切片，觀察腫瘤組織熒光表達情況。④細胞凋亡檢測:用原位末端轉移酶標記技術細胞凋亡。將各組裸鼠腫瘤石蠟切片脫蠟至水，用二甲苯浸洗2次，每次5min;用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3min;滴加20μg/mL蛋白酶K，21～37℃作用15～30min;PBS漂洗2次;將酶液和標記液按1∶9比例配置成TUNEL反應液(冰浴上操作)，將反應液滴加于切片上，置于37℃恒溫箱避光孵育60min。并做陰性及陽性對照;PBS洗滌，滴加POD轉化液后，置于37℃恒溫箱孵育30min;PBS洗滌，DAB顯色，復染細胞核，脫水透明，中性樹膠封片。計算各組細胞凋亡指數。

1．5統(tǒng)計學分析實驗所得數據應用SPSS17．0軟件進行方差分析，各組數據采用x珋±s表示，組間率的比較采用卡方檢驗，計數資料比較采用兩樣本t檢驗，多樣本LSD－t檢驗，以P＜0．05為有統(tǒng)計學意義，P＜0．01為顯著性差異。

2結果

2．1藥物姜黃素濃度的確定我們預實驗在經姜黃素處理人直腸癌HR8348細胞顯示24h后，HR8348細胞增殖受到抑制。24h后1μM、3μM濃度的其生長抑制率分別為(1．9±0．3)%、(4．7±0．5)%。結合參考其他文獻，根據放療增敏劑的篩選原則［1］，在隨后的實驗中我們選用低藥物濃度的姜黃素均為2．5μmol/L。

2．2體外實驗

2．2．1MTT法檢測各組腫瘤細胞的生長抑制情況給予2．5μmol/L姜黃素處理，MTT法檢測細胞生長抑制情況見插頁Ⅲ圖1:在不同劑量X射線作用后對照組與姜黃素組細胞生長抑制率沒有明顯變化，照射組細胞生長抑制率呈逐漸上升趨勢，聯合組細胞生長抑制率上升較照射組快。與對照組，黃素組，照射組比較，聯合組細胞抑制率及凋亡率明顯高于對照組，姜黃素組及照射組(P＜0．05)。

2．2．2AnnexinV－PI雙染法檢測各組腫瘤細胞的凋亡情況插頁Ⅲ圖2顯示AnnexinV－PI檢測細胞凋亡情況，經10GyX射線作用后，24h、48h兩個時間點檢測到的各組細胞凋亡情況顯示:24h與對照組凋亡率6%相比，姜黃素組凋亡率分別為4%、單純照射組17%、聯合組33%;48h與對照組凋亡率9%相比，姜黃素組凋亡率分別為11%、單純照射組29%、聯合組42%。對照組及姜黃素組的細胞凋亡率無顯著性差異(P＞0．05)，照射組和聯合組的細胞凋亡率均明顯高于對照組及姜黃素組，有顯著性差異(P＜0.01)，聯合組的細胞凋亡率高于照射組細胞凋亡率(P＜0．05)，說明姜黃素可以顯著增加HR8348細胞的放射敏感性。

2．2．3姜黃素對裸鼠瘤體生長延緩的作用所有裸鼠均接種成功，1周左右可見皮下腫瘤形成，接種后2周左右腫瘤直徑達0．6～0．8cm。裸鼠瘤體的生長曲線見插頁Ⅲ圖3:6d以后可以看出對照組及姜黃素組腫瘤的生長明顯快于其他兩組，照射組與聯合組間無明顯差異;9d以后可以看出對照組腫瘤的生長明顯快于其他3組，姜黃素組和照射組腫瘤生長明顯快于聯合組;15d以后對照組與照射組、姜黃素組、聯合組間均有顯著性差異(P＜0．01)，照射組和姜黃素組與對照組間均有顯著性差異(P＜0．01)。聯合組與照射組間有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。

2．2．4TUNEL法檢測細胞凋亡TUNEL法檢測細胞凋亡見插頁Ⅲ圖4:陰性對照組偶可見凋亡細胞;姜黃素組中凋亡細胞數量少;照射組中凋亡細胞增多;聯合治療組尤為明顯，細胞凋亡最多。經多個樣本均數間每兩個均數比較的q檢驗，姜黃素組、照射組、聯合組與陰性對照組凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，聯合組與陰性對照組凋亡率比較，二者之間顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)，聯合組分別與姜黃素組及照射組凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。

3討論

直腸癌術后局部復發(fā)是治療失敗的主要原因，經過綜合治療，直腸癌根治性切除術后5年生存率在60%左右，早期直腸癌術后的5年生存率可達80%～90%［2－3］。放療目前已成為直腸癌綜合治療中的重要措施，美國NCCN(NationalComprehensiveCancerNetwork)公布的進展期直腸癌治療指南中，推薦使用PRT(Preoperativeradiotherapy)。有數據表明，體內腫瘤是由于體內穩(wěn)態(tài)的調控機制失控而發(fā)生，這一調控機制是通過細胞凋亡來實現的。放化療其療效均主要是通過誘導腫瘤細胞凋亡而實現，大量研究表明，射線作用于腫瘤細胞引起各種損傷而導致細胞死亡的主要機制是誘導細胞凋亡［4］。促使腫瘤G1/S期細胞進入并停留在G2/M期，是提高腫瘤放射敏感性的一個重要途徑［5］。姜黃Cur(curcuma)是我國國粹中藥，由于其作用靶點多，自身不良反應少，在逆轉耐藥的同時有殺傷腫瘤細胞、調節(jié)和提高機體免疫功能的多重功效，其逆轉腫瘤多藥耐藥的作用已日益引起人們的重視。SantoshK．Sandur［6］等研究表明，姜黃素對結腸腫瘤細胞放療具有增敏作用，其機制可能與抑制NF－κB蛋白質磷酸化有關。曹璋［7］等人的實驗也證實姜黃素可通過將鼻咽癌的細胞周期阻滯在G2/M期而起到放射增敏作用。美國國立腫瘤所已將其列為第三代癌化學預防藥［8］。研究發(fā)現，姜黃素可抑制多種腫瘤細胞的生長，并誘導其凋亡;尤其在抗腫瘤同時，能提高患者免疫力［9－10］不損害正常體細胞，其引起腫瘤細胞凋亡的機制可能與其下調NF－κB活性，調節(jié)下游凋亡調控基因Bcl－2/Bax的表達有關。本研究通過MTT實驗表明，姜黃素對Hr8348細胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈明顯的量效和時效關系，根據我們預實驗結果及放療增敏劑的篩選原則，選取對細胞生長抑制率≤5%的低藥物濃度(2．5μmol/L)作為研究姜黃素放療增敏的最佳藥物濃度，結果顯示:①體外實驗:照射組、聯合組腫瘤細胞抑制率及凋亡率均明顯高于對照組，聯合組高于照射組(P＜0．05);②體內實驗:觀察對照組、姜黃素組、照射組及聯合組的腫瘤生長曲線，結果表明姜黃素組注藥第3d開始瘤體呈緩慢生長趨勢;與對照組比較差異無顯著性(P＞0．05)，6d以后可以看出對照組、姜黃素組腫瘤的生長明顯快于其他2組，15d以后對照組、姜黃素組、照射組腫瘤生長明顯快于聯合組，聯合組與對照組、姜黃素組、照射組比較，瘤體生長緩慢明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05);聯合組與陰性對照組凋亡率比較，二者之間顯著性差異(P＜0．01)，聯合組與照射組凋亡率比較(P＜0．05);究其原因，我們認為單獨姜黃素組抑制腫瘤作用有限，但配合放療起協同作用，有一定的放療增敏作用。近年來，對姜黃素的抗癌作用的實驗表明姜黃素可抑制體內、外腫瘤細胞的生長［11－12］，姜黃素可使腫瘤體積及重量均明顯受到抑制［13］。考慮姜黃素自身的抗癌作用，我們實驗選用低劑量的姜黃素以排除高劑量姜黃素自身對腫瘤的影響，本實驗顯示姜黃素可誘導腫瘤細胞凋亡，配合放療可增加放射敏感性，是方法簡單且經濟的治療模式。但低劑量姜黃素配合放療對人直腸癌腫瘤細胞株生長和凋亡的影響方面的研究目前國內外還鮮有報道，我們的探索尚處于起步，需要進一步的深入研究。

作者：陸新建裘建明楊關根王幸封巍沈忠單位：興化市人民醫(yī)院