中藥能顯著減弱大鼠腎組織范文

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1、材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，雄性，體重（180～200）g，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：SCXK（魯）20030004。

1.1.2藥品與試劑化痰活血軟堅(jiān)湯由海藻、丹參、大黃、黃芪、當(dāng)歸組成。上藥水煎2次，大黃后入，濾取藥液合并，減壓濃縮（80℃）為0.4g/mL，低溫保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们胺胖潦覝夭u勻。親和純化兔抗人多克隆TGF-β1抗體：SantaCruzBiotechnology，Inc.產(chǎn)品；FITC-羊抗兔IgG、TGF-β1mRNA原位雜交試劑盒、MMP-9mRNA原位雜交試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。鹽酸多柔比星，深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：0103E1，使用時(shí)以生理鹽水稀釋成1mg/mL的溶液。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組將40只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組10只、模型組15只、中藥組15只，自由飲水進(jìn)食，1w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2模型制備30只大鼠稱重，腹腔注射（0.2mL/100g體重）1.75%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液麻醉，從背部摘除左腎，縫合傷口。正常組行假手術(shù)，不摘除腎臟，余與上同。手術(shù)1w后，30只造模大鼠尾靜脈注射阿霉素5mg/kg，手術(shù)5w后注射阿霉素3mg/kg。正常組尾靜脈注射生理鹽水。

1.2.3給藥方法第1次注射阿霉素1w后，中藥組灌服中藥（1mL/100g體重），正常組和模型組給予等量蒸餾水。連續(xù)給藥12w。

1.2.4標(biāo)本采集摘取右腎，迅速冠狀切開，分別以10%甲醛和4%多聚甲醛（DEPC水配制）固定，石蠟包埋。甲醛固定組織切片厚度4μm，多聚甲醛固定組織切片厚度6μm。

1.2.5指標(biāo)觀察

1.2.5.1腎組織TGF-β1檢測采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。兔抗人TGF-β1抗體1∶100稀釋，PBS代替一抗作為陰性對照。激光共聚焦顯微鏡觀察，并用LaserMicrscopeLSM510Version2.5SP2軟件處理，每張切片任選5個(gè)視野，計(jì)算其平均熒光強(qiáng)度，作為該樣本TGF-β1的相對表達(dá)量。

1.2.5.2腎組織TGF-β1mRNA、MMP-9mRNA檢測采用原位雜交法。OLYMPUSBX41光學(xué)顯微鏡觀察，每張切片任選10個(gè)腎小球，OLYMPUSC-4000ZOOM數(shù)碼相機(jī)照相（光亮度設(shè)定一致），用Image-proplus4.5圖像分析軟件對結(jié)果進(jìn)行半定量分析，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，測定10個(gè)視野的積分光密度，以均值作為該樣本MMP-9mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以SPSS11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2、結(jié)果

2.1各組大鼠腎組織TGF-β1mRNA、TGF-β1及MMP-9mRNA的表達(dá)

結(jié)果見表1。

由表1可知，模型組大鼠腎組織TGF-β1mRNA、TGF-β1表達(dá)顯著高于正常組（P＜0.01），中藥組大鼠二者的表達(dá)顯著低于模型組（P＜0.01）。模型組大鼠腎組織MMP-9mRNA表達(dá)比正常組顯著降低（P＜0.01），而中藥組大鼠腎組織MMP-9mRNA表達(dá)則比模型組顯著升高（P＜0.01）。

3、討論

TGF-β1是腎小球疾病進(jìn)展的重要介導(dǎo)因子，在免疫介導(dǎo)及非免疫介導(dǎo)的腎臟損傷模型中，系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及浸潤巨噬細(xì)胞均可合成TGF-β1。在慢性腎衰復(fù)雜的病理機(jī)制中，如腎小球的高灌注、高濾過，腎小管損傷和間質(zhì)纖維化，蛋白尿促進(jìn)腎小球間質(zhì)纖維化等多個(gè)環(huán)節(jié)均有TGF-β1參與。TGF-β1促進(jìn)系膜細(xì)胞產(chǎn)生部分ECM并抑制其降解，增加細(xì)胞對ECM的黏附，促進(jìn)ECM在腎小球內(nèi)積聚，并有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的作用，從而直接參與腎小球硬化過程。腎臟病理組織學(xué)研究表明，在已有病變的腎小球中TGF-β1主要通過至少3種途徑促進(jìn)ECM的積聚：①促進(jìn)ECM成分如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原和多種蛋白多糖的合成；②抑制ECM的降解，既抑制降解ECM成分的酶類如膠原酶系的合成，又促進(jìn)纖溶酶原激活物抑制因子和金屬蛋白酶組織抑制因子等的表達(dá)；③促進(jìn)整合素的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)ECM表達(dá)［1］。

MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，又稱為Ⅳ型膠原酶，對ECM的合成和分解起著重要的作用，其功能是參與ECM（主要為Ⅳ型膠原）的降解。既往研究證實(shí)腎小球固有細(xì)胞可合成和分泌MMP-9，與MMP-2共同參與保持腎組織ECM的動(dòng)態(tài)平衡［2］。MMP-9分泌減少或其抑制物TIMP-1分泌增加，均可成為ECM積聚的重要原因。

本研究結(jié)果表明，化痰活血軟堅(jiān)中藥能顯著減弱模型大鼠腎組織TGF-β1mRNA、TGF-β1的高表達(dá)，提示化痰活血軟堅(jiān)法抗腎小球硬化的效應(yīng)與其抑制TGF-β1mRNA表達(dá)及TGF-β1的分泌，從而減少ECM的積聚有關(guān)。化痰活血軟堅(jiān)中藥還具有促進(jìn)MMP-9mRNA表達(dá)的作用，表明化痰活血軟堅(jiān)法可能通過促進(jìn)MMP-9mRNA表達(dá)而增加MMP-9的產(chǎn)生和分泌，參與ECM的降解，因而發(fā)揮防治腎小球硬化的作用。