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大鼠肝臟與蛋白的變化范文

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大鼠肝臟與蛋白的變化

《航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程雜志》2014年第三期

1方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物二級(jí)雄性SD大鼠100只,體重180~260g(航空醫(yī)學(xué)研究所提供),適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后隨機(jī)分為4組,每組25只。其中3組為+Gz暴露組,1組為正常對(duì)照組。

1.2試劑與儀器逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(Promega公司);OligoDT,dNTP(10mmol/L)(Takara公司);TRIzol(Invitro-gen公司);大鼠誘導(dǎo)型HSP70cDNA序列(EF100780)、PCR反應(yīng)體系、HSP70兔抗鼠多克隆抗體、GAPDH鼠抗單克隆抗體(南京金斯瑞);ECL化學(xué)發(fā)光試劑、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(上海江萊);X光片自動(dòng)洗片機(jī)(柯達(dá)X-OMATBT膠片(FF057/FF081));心臟灌注設(shè)備;恒溫冰凍切片機(jī);Quantimet圖像分析系統(tǒng)(德國Leica);動(dòng)物離心機(jī)等。

1.3+Gz暴露3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別用離心機(jī)進(jìn)行+Gz暴露。暴露時(shí)將大鼠置于一內(nèi)徑為17cm×8cm×5cm的樹脂盒中,頭部朝向旋轉(zhuǎn)軸心,尾部向外水平并被固定于離心機(jī)的平臺(tái)上,分別暴露于+2Gz,+6Gz,+10Gz,峰值作用時(shí)間3min,加速度增長率1G/s。對(duì)照組同樣條件置于樹脂盒中,但不進(jìn)行+Gz暴露。

1.4樣本制備分別于暴露后6h、12h、24h、48h、96h,腹腔注射苯巴比妥鈉50mg/kg麻醉大鼠,生理鹽水心臟灌注后用4%多聚甲醛灌注2h,迅速取肝臟組織,液氮冷凍,-80℃保存。標(biāo)本取齊后,包埋肝臟組織,于恒冷切片機(jī)中冰凍切片。

1.5RNA提取及RT-PCR檢測取凍存裂解的細(xì)胞,Trizol法提取細(xì)胞RNA,測定RNA濃度和純度。獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。利用逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物。HSP70引物上游5’-GGTGCTGACGAAGATAAAGGAC-3’,下游5’-TCGATG-GCCTCGAACAGAG-3’。β-actin引物:上游5’-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’,下游5’-GAGGGACTTCCTGTAACCAC-3’。配制PCR反應(yīng)體系(25μL):cDNA2μL,上、下游引物(10μmol/L)各1μL,2×TaqMastermix12.5μL,加ddH2O補(bǔ)齊至25μL。92℃預(yù)變性5min,然后92℃30s,54℃30s,72℃30s共32個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取10μL產(chǎn)物,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含0.5g/mL溴化乙錠)電泳,紫外燈下觀察、拍照,計(jì)算HSP70與β-actin條帶灰度比值。

1.6Westernblot分析收集蛋白樣品,電泳,轉(zhuǎn)膜(PVDF膜,Milli-pore公司,美國),TBST洗膜,然后再以含5%脫脂奶粉的TBST38℃封閉1h。分別加入HSP70兔抗鼠多克隆抗體(1∶800稀釋)和GAPDH鼠抗單克隆抗體(1∶4000稀釋),4℃孵育過夜,TBST洗滌后,GAPDH直接通過ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影;HSP70再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶10000稀釋),38℃孵育60min,TBST洗滌,ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影。HSP70蛋白相對(duì)含量用HSP70/GAPDH灰度比值表示。

1.7統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,利用HSP70/GAPDH灰度比值及HSP70與內(nèi)對(duì)照β-actin條帶灰度比值采用重復(fù)設(shè)計(jì)的方差分析進(jìn)行組內(nèi)及組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1+Gz暴露大鼠肝臟HSP70mRNA表達(dá)+Gz暴露12h各組電泳分析結(jié)果見圖1,HSP70擴(kuò)增片段為550bp,β-actin擴(kuò)增片段為623bp。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組HSP70陽性表達(dá)率為100%。+Gz暴露后大鼠肝臟HSP70mRNA表達(dá)趨勢(HSP70/β-actin值)如圖2所示??梢钥闯?,暴露后6h,各+Gz暴露組大鼠肝臟組織HSP70mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)。暴露后6h、12h、24h、48h4個(gè)時(shí)間點(diǎn),各+Gz暴露組大鼠肝臟HSP70mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05);+6Gz組大鼠肝臟HSP70mRNA表達(dá)水平均高于+2Gz和+10Gz組(P<0.05)。+6Gz暴露后12h大鼠肝臟HSP70mRNA表達(dá)水平最高(P<0.05),+2Gz組HSP70mRNA表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯高于+10Gz組(P<0.05),暴露后48h,+2Gz組與+6Gz組HSP70mRNA表達(dá)水平無明顯差別,但此時(shí)+2Gz組與+6Gz組HSP70mRNA表達(dá)水平高于+10Gz組(P<0.05)。暴露后96h,各+Gz組大鼠HSP70mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2+Gz暴露對(duì)HSP70蛋白表達(dá)的影響以GAPDH為內(nèi)參照,HSP70蛋白表達(dá)量的Westernblot結(jié)果見圖3,各組不同時(shí)間+Gz暴露后HSP70表達(dá)趨勢(HSP70/GAPDH)如圖4所示??梢钥闯觯?Gz暴露后6h、12h、24h、48h4個(gè)時(shí)間點(diǎn),3個(gè)+Gz暴露組HSP70蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。+Gz暴露后6h、12h、24h、48h,+6Gz組HSP70表達(dá)水平高于+2Gz組、+10Gz組(P0.05),+2G組表達(dá)高于+10Gz組(P<0.05)。暴露后6h,+2Gz組、+6Gz組HSP70蛋白表達(dá)高于+10Gz組(P<0.05)。暴露后12h,+2Gz組、+6Gz組HSP70蛋白表達(dá)高于+10Gz組(P<0.05)。其中+6Gz暴露后12hHSP70蛋白表達(dá)最高,差異有顯著性意義(P<0.05)。+Gz暴露后96h,各+Gz組大鼠肝臟HSP70表達(dá)水平與對(duì)照組相比,差異無顯著性(P>0.05)。

3討論

研究表明,在受到加速度、缺血、缺氧、熱暴露等因素作用后的生物體通過激活HSF、HSE并與之相結(jié)合等步驟,誘導(dǎo)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生HSP70mR-NA,HSP70mRNA再經(jīng)轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過調(diào)節(jié)、翻譯等步驟表達(dá)產(chǎn)生HSP70[8]。本研究結(jié)果提示+Gz暴露可刺激肝臟HSP70mRNA及蛋白的表達(dá)。本研究中,+Gz暴露誘導(dǎo)產(chǎn)生HSP70mRNA的機(jī)制,一方面可能是+Gz暴露導(dǎo)致肝組織相對(duì)缺血、缺氧,誘導(dǎo)肝臟組織產(chǎn)生HSP70mRNA。進(jìn)一步經(jīng)過轉(zhuǎn)錄翻譯后生成HSP70,這與既往肝缺血模型誘導(dǎo)HSP70mRNA及HSP70表達(dá)的機(jī)制是相同的[9-10]。除此之外,+Gz暴露時(shí)造成的機(jī)體相關(guān)臟器的高壓力及其在加速度作用下所受到的機(jī)械擠壓等力學(xué)因素,可能在HSP70mRNA的誘導(dǎo)產(chǎn)生中也起著一定的作用,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。目前,絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為HSP70對(duì)缺血、缺氧所致的肝損傷有保護(hù)作用。主要有分子伴侶作用、抗炎作用、免疫調(diào)節(jié)作用、抑制細(xì)胞凋亡及抗氧化作用[10-14]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,+6Gz暴露組誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70mRNA及HSP70表達(dá)水平最高,+2Gz組次之,+10Gz組相對(duì)較低。說明在一定G值范圍內(nèi),隨+Gz暴露強(qiáng)度的增加,HSP70mRNA及HSP70的表達(dá)水平也相應(yīng)增高,中等強(qiáng)度G值(+6Gz)作用下,誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70mRNA及HSP70量最多。但當(dāng)G值超過一定限度時(shí),隨G值水平的增加,HSP70mRNA及蛋白的表達(dá)水平反而相對(duì)下降。輕度和中度的缺血、缺氧刺激作用時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70mRNA及其產(chǎn)物的表達(dá)水平較高,表達(dá)分布范圍也較廣,而在重度缺血條件下,肝組織的HSP70mRNA及HSP70的表達(dá)反而會(huì)受到相對(duì)抑制,誘導(dǎo)產(chǎn)生的mRNA及HSP70蛋白的水平相對(duì)較低,分布范圍也較局限,可能與重度缺血造成臟器組織細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷,使得細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程受到抑制有關(guān)[3-4]。實(shí)驗(yàn)顯示,HSP70基因及其產(chǎn)物在正常大鼠肝臟內(nèi)含量較低,當(dāng)應(yīng)激因素(加速度)作用于生物體時(shí),HSP70基因被激活而迅速表達(dá)。正加速度暴露后12h,+2Gz組、+6Gz組、+10Gz組所產(chǎn)生的HSP70mRNA及HSP70變化趨勢具有一致性,表明其基因無內(nèi)含子結(jié)構(gòu),形成的mRNA無需切割修飾,蛋白的組裝能夠在短時(shí)間內(nèi)完成,HSP70誘導(dǎo)型蛋白可以迅速表達(dá)[1]。

4結(jié)論

+Gz暴露可以誘導(dǎo)大鼠肝臟組織HSP70mRNA及HSP70蛋白的表達(dá),使大鼠肝臟組織中HSP70mRNA及HSP70蛋白表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。+Gz暴露環(huán)境下機(jī)體可能通過代償機(jī)制增加HSP70表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)肝臟的保護(hù),其具體機(jī)制我們將在今后的實(shí)驗(yàn)中作進(jìn)一步的研究。

作者:朱懷成張洪義劉承利張宏義趙剛孔亞林單位:安徽醫(yī)科大學(xué)空軍總醫(yī)院肝膽外科

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