大鼠肝臟與蛋白的變化范文

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《航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程雜志》2014年第三期

1方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物二級(jí)雄性SD大鼠100只，體重180～260g(航空醫(yī)學(xué)研究所提供)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后隨機(jī)分為4組，每組25只。其中3組為+Gz暴露組，1組為正常對(duì)照組。

1．2試劑與儀器逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(Promega公司);OligoDT，dNTP(10mmol/L)(Takara公司);TRIzol(Invitro-gen公司);大鼠誘導(dǎo)型HSP70cDNA序列(EF100780)、PCR反應(yīng)體系、HSP70兔抗鼠多克隆抗體、GAPDH鼠抗單克隆抗體(南京金斯瑞);ECL化學(xué)發(fā)光試劑、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(上海江萊);X光片自動(dòng)洗片機(jī)(柯達(dá)X-OMATBT膠片(FF057/FF081));心臟灌注設(shè)備;恒溫冰凍切片機(jī);Quantimet圖像分析系統(tǒng)(德國Leica);動(dòng)物離心機(jī)等。

1．3+Gz暴露3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別用離心機(jī)進(jìn)行+Gz暴露。暴露時(shí)將大鼠置于一內(nèi)徑為17cm×8cm×5cm的樹脂盒中，頭部朝向旋轉(zhuǎn)軸心，尾部向外水平并被固定于離心機(jī)的平臺(tái)上，分別暴露于+2Gz，+6Gz，+10Gz，峰值作用時(shí)間3min，加速度增長率1G/s。對(duì)照組同樣條件置于樹脂盒中，但不進(jìn)行+Gz暴露。

1．4樣本制備分別于暴露后6h、12h、24h、48h、96h，腹腔注射苯巴比妥鈉50mg/kg麻醉大鼠，生理鹽水心臟灌注后用4%多聚甲醛灌注2h，迅速取肝臟組織，液氮冷凍，－80℃保存。標(biāo)本取齊后，包埋肝臟組織，于恒冷切片機(jī)中冰凍切片。

1．5RNA提取及RT-PCR檢測取凍存裂解的細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞RNA，測定RNA濃度和純度。獲得的RNA溶液保存于－80℃待用。利用逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用Premier5．0軟件設(shè)計(jì)引物。HSP70引物上游5’-GGTGCTGACGAAGATAAAGGAC-3’，下游5’-TCGATG-GCCTCGAACAGAG-3’。β-actin引物:上游5’-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’，下游5’-GAGGGACTTCCTGTAACCAC-3’。配制PCR反應(yīng)體系(25μL):cDNA2μL，上、下游引物(10μmol/L)各1μL，2×TaqMastermix12．5μL，加ddH2O補(bǔ)齊至25μL。92℃預(yù)變性5min，然后92℃30s，54℃30s，72℃30s共32個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取10μL產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含0．5g/mL溴化乙錠)電泳，紫外燈下觀察、拍照，計(jì)算HSP70與β-actin條帶灰度比值。

1．6Westernblot分析收集蛋白樣品，電泳，轉(zhuǎn)膜(PVDF膜，Milli-pore公司，美國)，TBST洗膜，然后再以含5%脫脂奶粉的TBST38℃封閉1h。分別加入HSP70兔抗鼠多克隆抗體(1∶800稀釋)和GAPDH鼠抗單克隆抗體(1∶4000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗滌后，GAPDH直接通過ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影;HSP70再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶10000稀釋)，38℃孵育60min，TBST洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影。HSP70蛋白相對(duì)含量用HSP70/GAPDH灰度比值表示。

1．7統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件，利用HSP70/GAPDH灰度比值及HSP70與內(nèi)對(duì)照β-actin條帶灰度比值采用重復(fù)設(shè)計(jì)的方差分析進(jìn)行組內(nèi)及組間兩兩比較。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1+Gz暴露大鼠肝臟HSP70mRNA表達(dá)+Gz暴露12h各組電泳分析結(jié)果見圖1，HSP70擴(kuò)增片段為550bp，β-actin擴(kuò)增片段為623bp。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組HSP70陽性表達(dá)率為100%。+Gz暴露后大鼠肝臟HSP70mRNA表達(dá)趨勢(HSP70/β-actin值)如圖2所示?？梢钥闯?，暴露后6h，各+Gz暴露組大鼠肝臟組織HSP70mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組相比顯著升高(P＜0．05)。暴露后6h、12h、24h、48h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各+Gz暴露組大鼠肝臟HSP70mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P＜0．05);+6Gz組大鼠肝臟HSP70mRNA表達(dá)水平均高于+2Gz和+10Gz組(P＜0．05)。+6Gz暴露后12h大鼠肝臟HSP70mRNA表達(dá)水平最高(P＜0．05)，+2Gz組HSP70mRNA表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯高于+10Gz組(P＜0．05)，暴露后48h，+2Gz組與+6Gz組HSP70mRNA表達(dá)水平無明顯差別，但此時(shí)+2Gz組與+6Gz組HSP70mRNA表達(dá)水平高于+10Gz組(P＜0．05)。暴露后96h，各+Gz組大鼠HSP70mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

2．2+Gz暴露對(duì)HSP70蛋白表達(dá)的影響以GAPDH為內(nèi)參照，HSP70蛋白表達(dá)量的Westernblot結(jié)果見圖3，各組不同時(shí)間+Gz暴露后HSP70表達(dá)趨勢(HSP70/GAPDH)如圖4所示?？梢钥闯觯?Gz暴露后6h、12h、24h、48h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，3個(gè)+Gz暴露組HSP70蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。+Gz暴露后6h、12h、24h、48h，+6Gz組HSP70表達(dá)水平高于+2Gz組、+10Gz組(P0．05)，+2G組表達(dá)高于+10Gz組(P＜0．05)。暴露后6h，+2Gz組、+6Gz組HSP70蛋白表達(dá)高于+10Gz組(P＜0．05)。暴露后12h，+2Gz組、+6Gz組HSP70蛋白表達(dá)高于+10Gz組(P＜0．05)。其中+6Gz暴露后12hHSP70蛋白表達(dá)最高，差異有顯著性意義(P＜0．05)。+Gz暴露后96h，各+Gz組大鼠肝臟HSP70表達(dá)水平與對(duì)照組相比，差異無顯著性(P＞0．05)。

3討論

研究表明，在受到加速度、缺血、缺氧、熱暴露等因素作用后的生物體通過激活HSF、HSE并與之相結(jié)合等步驟，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生HSP70mR-NA，HSP70mRNA再經(jīng)轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過調(diào)節(jié)、翻譯等步驟表達(dá)產(chǎn)生HSP70［8］。本研究結(jié)果提示+Gz暴露可刺激肝臟HSP70mRNA及蛋白的表達(dá)。本研究中，+Gz暴露誘導(dǎo)產(chǎn)生HSP70mRNA的機(jī)制，一方面可能是+Gz暴露導(dǎo)致肝組織相對(duì)缺血、缺氧，誘導(dǎo)肝臟組織產(chǎn)生HSP70mRNA。進(jìn)一步經(jīng)過轉(zhuǎn)錄翻譯后生成HSP70，這與既往肝缺血模型誘導(dǎo)HSP70mRNA及HSP70表達(dá)的機(jī)制是相同的［9-10］。除此之外，+Gz暴露時(shí)造成的機(jī)體相關(guān)臟器的高壓力及其在加速度作用下所受到的機(jī)械擠壓等力學(xué)因素，可能在HSP70mRNA的誘導(dǎo)產(chǎn)生中也起著一定的作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。目前，絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為HSP70對(duì)缺血、缺氧所致的肝損傷有保護(hù)作用。主要有分子伴侶作用、抗炎作用、免疫調(diào)節(jié)作用、抑制細(xì)胞凋亡及抗氧化作用［10-14］。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，+6Gz暴露組誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70mRNA及HSP70表達(dá)水平最高，+2Gz組次之，+10Gz組相對(duì)較低。說明在一定G值范圍內(nèi)，隨+Gz暴露強(qiáng)度的增加，HSP70mRNA及HSP70的表達(dá)水平也相應(yīng)增高，中等強(qiáng)度G值(+6Gz)作用下，誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70mRNA及HSP70量最多。但當(dāng)G值超過一定限度時(shí)，隨G值水平的增加，HSP70mRNA及蛋白的表達(dá)水平反而相對(duì)下降。輕度和中度的缺血、缺氧刺激作用時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70mRNA及其產(chǎn)物的表達(dá)水平較高，表達(dá)分布范圍也較廣，而在重度缺血條件下，肝組織的HSP70mRNA及HSP70的表達(dá)反而會(huì)受到相對(duì)抑制，誘導(dǎo)產(chǎn)生的mRNA及HSP70蛋白的水平相對(duì)較低，分布范圍也較局限，可能與重度缺血造成臟器組織細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷，使得細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程受到抑制有關(guān)［3-4］。實(shí)驗(yàn)顯示，HSP70基因及其產(chǎn)物在正常大鼠肝臟內(nèi)含量較低，當(dāng)應(yīng)激因素(加速度)作用于生物體時(shí)，HSP70基因被激活而迅速表達(dá)。正加速度暴露后12h，+2Gz組、+6Gz組、+10Gz組所產(chǎn)生的HSP70mRNA及HSP70變化趨勢具有一致性，表明其基因無內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，形成的mRNA無需切割修飾，蛋白的組裝能夠在短時(shí)間內(nèi)完成，HSP70誘導(dǎo)型蛋白可以迅速表達(dá)［1］。

4結(jié)論

+Gz暴露可以誘導(dǎo)大鼠肝臟組織HSP70mRNA及HSP70蛋白的表達(dá)，使大鼠肝臟組織中HSP70mRNA及HSP70蛋白表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。+Gz暴露環(huán)境下機(jī)體可能通過代償機(jī)制增加HSP70表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)肝臟的保護(hù)，其具體機(jī)制我們將在今后的實(shí)驗(yàn)中作進(jìn)一步的研究。

作者：朱懷成張洪義劉承利張宏義趙剛孔亞林單位：安徽醫(yī)科大學(xué)空軍總醫(yī)院肝膽外科