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【摘要目的摘要：通過體外分離和培養(yǎng)胎盤貼壁細(xì)胞，以探究其形態(tài)、表型和分化特征.方法摘要：采用IV型膠原酶消化人胎盤組織，獲得單個(gè)核細(xì)胞，接種于100mL/LFBS低糖DMEM培養(yǎng)基中，貼壁后常規(guī)換液、傳代，流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志，繪制生長曲線.采用β甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松聯(lián)合誘導(dǎo)，使胎盤貼壁細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，誘導(dǎo)后10d行茜素紅染色；采用地塞米松、胰島素誘導(dǎo)，使胎盤貼壁細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，油紅O染色鑒定.結(jié)果摘要：培養(yǎng)7~14d后有少量貼壁細(xì)胞生長，逐漸呈成纖維細(xì)胞狀，表達(dá)CD29，CD44和CD105，不表達(dá)CD34，CD45，CD19；在成骨誘導(dǎo)10d后細(xì)胞茜素紅染色可見鈣鹽沉積，成脂肪誘導(dǎo)7d后油紅O染色見脂肪滴形成.結(jié)論摘要：通過不同方式誘導(dǎo)培養(yǎng)，胎盤貼壁細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞，提示胎盤貼壁細(xì)胞可能是新的干細(xì)胞來源.
【胎盤；貼壁細(xì)胞；干細(xì)胞
0引言
間充質(zhì)干細(xì)胞（marrowstromalcell,MSC）主要來源于骨髓，可以分化為多種組織細(xì)胞摘要：成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)細(xì)胞等，但隨著年齡增長或合并感染、腫瘤等疾病時(shí)骨髓干細(xì)胞的分化能力明顯下降，因此尋找新的干細(xì)胞成為當(dāng)務(wù)之急.近幾年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)胎盤組織中存在MSC.為進(jìn)一步證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，我們從胎盤中提取貼壁細(xì)胞，觀察其生物學(xué)特性，以探索其是否具有干細(xì)胞特性.
1材料和方法
1.1材料足月剖宮產(chǎn)的胎盤（產(chǎn)婦同意），低糖DMEM（Gibco公司），新生牛血清（FBS，Gibco公司），IV型膠原酶（Sigma公司），胰蛋白酶（Sigma公司），鼠抗人單克隆抗體CD19，CD44，CD45，CD105，CD34，CD29（晶美公司），茜素紅（Sigma），油紅O（Sigma），倒置顯微鏡（Olympas），CO2培養(yǎng)箱（Jouan）.
1.2方法
1.2.1胎盤貼壁細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取足月剖宮產(chǎn)胎盤，剪取胎兒側(cè)胎盤組織，PBS反復(fù)沖洗，剪成碎塊，以1g/LIV型膠原酶37℃消化30min，取上清液，以800r/min離心5min，沉淀物重復(fù)消化，收集每次離心后的細(xì)胞沉淀，PBS沖洗2遍，以1×107/L的密度接種于100mL/LFBSDMEM培養(yǎng)基中，貼壁后3~5d換液1次，取傳3代以上細(xì)胞備用.
1.2.2胎盤貼壁細(xì)胞的表型測定取第3代細(xì)胞，以2.5g/L胰蛋白酶消化3min，100mL/LFBS終止消化，PBS沖洗2遍，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×104/μL，分別加入鼠抗人單克隆抗體CD19,CD44,CD45,CD105,CD34，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型.
1.2.3生長曲線的繪制取第3代細(xì)胞，以2×107/L的密度接種于12孔板中，每日取3復(fù)孔，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)計(jì)數(shù)7d，計(jì)算平均值，繪制生長曲線.
1.2.4細(xì)胞周期測定取第3代細(xì)胞，以2.5g/L胰蛋白酶消化3min，10mol/LFBS終止消化，PBS沖洗2遍，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/L，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期.
1.2.5細(xì)胞誘導(dǎo)分化及染色取第3代胎盤細(xì)胞，以2.5g/L胰蛋白酶消化3min,10mol/LFBS終止消化，800r/min離心5min，PBS沖洗3遍，分為4組分別以1×105/L細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，1組加入成骨誘導(dǎo)劑（20mmol/Lβ甘油磷酸鈉、50mg/L維生素C，10mmol/L地塞米松，100mL/L新生牛血清DMEM培養(yǎng)基），2組加入脂肪誘導(dǎo)劑（10mmol/L地塞米松、10mg/L胰島素、100mL/L新生牛血清DMEM培養(yǎng)基），3,4組為對(duì)照組，采用100mL/L新生牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃，50mL/LCO2孵箱培養(yǎng)，每3~5日換液1次.取培養(yǎng)10d后的1，3組細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液，多聚甲醛固定30min，PBS沖洗3遍，茜素紅染色8h，顯微鏡下觀察陽性結(jié)果.取培養(yǎng)7d后的2，4組細(xì)胞，多聚甲醛固定后油紅O染色.
2結(jié)果
2.1胎盤細(xì)胞的原代培養(yǎng)消化胎盤組織獲得少量的單個(gè)核細(xì)胞，約7~14d后貼壁，從不規(guī)則形，逐漸變?yōu)樗笮危输鰷u狀生長，約4wk后長滿瓶底，胞體呈細(xì)長，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞（圖2），1wk左右傳代1次，可穩(wěn)定傳至10代.流式細(xì)胞儀檢測顯示低表達(dá)CD29，高表達(dá)CD44和CD105，不表達(dá)CD34，CD45和CD19.細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長期約在第2~4日，其倍增時(shí)間為39h（圖1）.流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)G0/G1，S，G2/M期的比例分別為20.15%,72.54%和6.89%.
圖1胎盤貼壁細(xì)胞生長曲線（略）
2.2胎盤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞在誘導(dǎo)10d時(shí)可見細(xì)胞呈漩渦狀重疊生長，并聚集成團(tuán)，茜素紅染色可見多個(gè)散在分布大小、形態(tài)各異的不透明棕紅色鈣化結(jié)節(jié).對(duì)照組少見鈣化結(jié)節(jié)（圖3）.成脂肪誘導(dǎo)組細(xì)胞在誘導(dǎo)7d時(shí)油紅O染色可見細(xì)胞中出現(xiàn)多個(gè)染色深紅的脂肪滴，而對(duì)照組中則偶見脂肪滴（圖4）.
A摘要：培養(yǎng)10d；B摘要：培養(yǎng)28d.
圖2胎盤原代細(xì)胞×100（略）
A摘要：誘導(dǎo)組;B摘要：對(duì)照組.
圖3成骨細(xì)胞茜素紅染色×100（略）
A摘要：誘導(dǎo)組；B摘要：對(duì)照組.
圖4成脂細(xì)胞油紅O染色×100（略）
3討論
早在2000年即有學(xué)者從凍存的胎盤組織中分離培養(yǎng)出貼壁細(xì)胞［1］，但胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的探究尚處于起步階段.我們從形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及分化能力等方面加以探究進(jìn)一步證實(shí)胎盤貼壁細(xì)胞的生物學(xué)特性.一般認(rèn)為大多數(shù)MSC培養(yǎng)時(shí)貼壁，呈成纖維細(xì)胞狀，因而采用貼壁法獲得MSC的探究較多［2］.胎盤是實(shí)體組織，富含血管和間充質(zhì)成分，我們采用酶消化法，獲取細(xì)胞沉淀進(jìn)行培養(yǎng)，和骨髓貼壁細(xì)胞相比較，其貼壁時(shí)間較長（1~2wk），骨髓為72h［3］，并且胎盤貼壁細(xì)胞需28d左右才能鋪滿瓶底.骨髓貼壁細(xì)胞大多最初為梭形，7d左右形成小集落，其后迅速生長，變?yōu)榫坏拈L梭形［3］，和胎盤貼壁細(xì)胞相似.另外我們的實(shí)驗(yàn)檢測到的胎盤貼壁細(xì)胞的倍增時(shí)間為39h，文獻(xiàn)中為37h［4］；我們檢測細(xì)胞周期顯示細(xì)胞大部分處于分裂期，而以往的報(bào)道發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大部分處于靜息期［4］，因而胎盤貼壁細(xì)胞的特性尚需進(jìn)一步研究.
目前對(duì)于胎盤貼壁細(xì)胞的免疫學(xué)特征尚無統(tǒng)一的熟悉，我們的探究發(fā)現(xiàn)胎盤貼壁細(xì)胞的表型和骨髓MSC相似［5-6］，表達(dá)CD29,CD44和CD105，不表達(dá)CD34,CD45,CD19,CD44,CD29均為黏附分子，是纖連蛋白和透明質(zhì)酸鹽的受體，在基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較多，這樣的結(jié)果使我們推測培養(yǎng)的胎盤貼壁細(xì)胞中可能包含大量的能表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志的細(xì)胞，即MSC，但僅憑細(xì)胞形態(tài)和少量的表面標(biāo)志尚不能完全說明貼壁細(xì)胞即為MSC，MSC的最重要特性應(yīng)該是多向分化潛能.
假如胎盤貼壁細(xì)胞中含有MSC，理論上講MSC來源于中胚層，具有向中胚層組織及神經(jīng)外胚層組織分化的能力［7-8］.我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)β甘油磷酸鈉和低濃度的地塞米松聯(lián)合誘導(dǎo)后細(xì)胞中鈣鹽沉積，茜素紅染色顯示產(chǎn)生大量鈣化結(jié)節(jié)，說明其有成骨能力，只有干細(xì)胞才具有這種能力.在誘導(dǎo)體系中維生素C可以促進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞合成膠原，形成鈣化，能調(diào)節(jié)ATP及ALP活性，并影響其合成，β甘油磷酸鈉可以提供磷離子作為ALP的底物，地塞米松可以增強(qiáng)ALP活性.而ALP可以破壞鈣化抑制劑，啟動(dòng)鈣化［8］形成鈣鹽，茜素紅特異性結(jié)合鈣劑，陽性表現(xiàn)為棕紅色，鈣的含量愈高染色愈深，是鑒定成骨細(xì)胞特性的特異性指標(biāo).
我們的實(shí)驗(yàn)由于條件限制，只是初步觀察胎盤貼壁細(xì)胞的特征，證實(shí)其具有干細(xì)胞特性，但尚有許多新問題如培養(yǎng)的條件、促進(jìn)生長的因子、傳代后是否逐漸衰老、誘導(dǎo)后移植的效果等等，需更深入的探究.我們的探究提示胎盤貼壁細(xì)胞的分離培養(yǎng)具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值.