人胎盤TRAIL基因cDNA克隆和鑒定范文

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作者：李紅梅,宋天保于月成,辛曉燕,張明,許靜洪

【摘要】目的：利用基因工程技術克隆TRAIL基因全長cDNA，并構建其原核表達載體.方法：從人胎盤中提取總RNA，利用RTPCR技術擴增了trail，將其連接于克隆載體pMD18T中，并通過酶切及測序鑒定載體構建的正確性.結果：應用RTPCR技術和BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切成功獲得1049bp的目的片段，測序分析結果表明該基因序列與報道的TRAIL基因片段的序列完全相同.結論：成功克隆了TRAIL基因的cdna全長，為其在腫瘤生物治療中的應用奠定了基礎.

【關鍵詞】腫瘤壞死因子;細胞凋亡;配體；RTPCR；序列測定；人胎盤

0引言

1995年Wiley和Pitt首次從人的表達標簽文庫中發現一個與腫瘤壞死因子家族基因序列具有高度同源性的DNA克隆，其表達的蛋白具有誘導細胞凋亡的功能，因而將其命名為腫瘤壞死因子相關誘導凋亡配體（tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand，TRAIL）［1-2］.作為一種新的凋亡誘導配體，腫瘤壞死因子相關誘導凋亡配體(TRAIL)自發現以來，就一直倍受關注.有關TRAIL和TRAIL受體以及其信號轉導通路的研究己取得很大進展，而TRAIL特異性誘導腫瘤細胞凋亡的分子調控機制目前尚未闡明.作為一種特異性誘導腫瘤細胞凋亡且無明顯毒副作用的分子，TRAIL極有可能成為新的抗腫瘤制劑［3-4］.研究表明，TRAIL在選擇性誘導腫瘤細胞凋亡的同時對正常組織沒有明顯細胞毒性，并且和放、化療有協同作用，使得TRAIL在腫瘤的治療上具有廣闊的前景［5-6］.我們采用RTPCR方法克隆了TRAIL全長的基因片段，經酶切和測序證實其正確性，為進一步研究及臨床應用奠定基礎.

1材料和方法

1.1材料大腸桿菌DH5α由第四軍醫大學西京醫院婦產科實驗室保存，pMD18T載體、EcoRI,BamHI內切酶、TaqDNA聚合酶、DNAMarkerDL2000購自大連TaKaRa公司，胰蛋白胨（Tryptone），酵母提取物（Yeastextract）購自英國OXOIDLTD公司，質粒抽提試劑盒及凝膠回收試劑盒購自安徽優晶生物工程有限公司，反轉錄試劑盒購自Fermentas公司，PCR引物由上海博亞生物工程有限公司合成.

1.2方法

1.2.1引物的設計與合成根據GenBank報道的TRAIL基因的序列并參照已發表的文獻設計合成兩條引物.上游引物P1序列為:5′GAATTCcggctgcctggctgacttac3′，劃線處為EcoRⅠ的酶切位點；下游引物P2序列為:5′GGATCCtttttggttgtggctgctctac3′，劃線處為BamHⅠ的酶切位點.

1.2.2胎盤組織中總RNA提取采用Trizol一步法提取人胎盤組織中總RNA.稱取100mg新鮮人胎盤組織，加入1mLTrizol勻漿，裂解5min.加入氯仿進行液相分離.取上層水相，轉至另一離心管中.加異丙醇沉淀，離心10min后棄上清，RNA沉淀于管底.加700mL/L乙醇洗滌，溫和震蕩離心管，懸浮沉淀.再次離心5min；盡量棄上清；37℃干燥后，溶于DEPC水中.取其中2μL溶液紫外分光光度計定量，其余貯存于-80℃待用.

1.2.3RTPCR取5μL總RNA，按Fermentas試劑盒的說明進行操作.擴增參數為：70℃水浴5min，37℃水浴5min，42℃水浴60min，70℃水浴15min，冰浴，待用.然后以cDNA為模板，PCR反應條件為：95℃變性3min后，按94℃30s，55℃30s，72℃1min的順序循環30次，再于72℃延伸7min.取PCR產物5μL在含溴化乙啶的10g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳.

1.2.4PCR產物的純化、克隆與鑒定PCR擴增產物電泳結束后，在紫外檢測儀下切取所需大小的凝膠片段，按凝膠回收試劑盒操作說明第一次回收目的片斷.將回收產物用EcoRI和BamHⅠ內切酶進行雙酶切第二次回收目的凝膠片段，酶切產物在含溴化乙啶的10g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳，緩沖液為0.5×TBE，電泳結束后，在紫外檢測儀下切取目標片段，第三次回收.取凝膠回收純化的PCR產物4μL加入pMD18T載體1μL,LigationSolutionⅠ5μL,16℃連接過夜.連接產物轉化感受態細菌DH5α,然后將連接產物涂布于含100μg/mL氨芐青霉素的固體LB培養基平板中,37℃培養過夜.挑取單菌落加入5mL含100μg/mL氨芐青霉素的液體LB培養基試管中,37℃培養過夜.采用質粒抽提試劑盒進行質粒抽提,對質粒進行EcoRI和BamHI雙酶切鑒定,鑒定陽性的載體送大連TAKARA公司測序.將測序證實完全正確的序列命名為pMD18TTRAIL,保存菌種.

2結果

2.1TRAIL基因的克隆提取胎盤組織總RNA，反轉錄合成cDNA第一鏈，以此為模板進行PCR,PCR產物的大小約為1049bp(圖1)，無雜帶、特異性良好,與我們所設計的相吻合，克隆后片段大小與PCR產物大小吻合.

2.2TRAIL基因重組載體的酶切鑒定用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切含有TRAIL基因的pMD18T載體，獲得大小為1049bp的目的片段(圖2)，表明含有TRAIL基因的克隆載體構建成功.

2.3TRAIL基因的序列分析以定向克隆入pMD18T載體中的TRAIL基因的PCR產物轉化E.coliDH5α,挑取均含有目的基因片段的5個菌落，取其中1個菌落做序列測定證實，所得序列的結果聯網到

NCBI進行同源性分析.核酸序列與質粒pMD18TTRAIL中的TRAIL序列同源性為99.69%，發現有兩個堿基突變.在NCBI的ORFfinder中，服務器分析開放閱讀框架，翻譯成281個氨基酸序列，進行同源性分析，同源性為100%.說明測序結果中的兩個堿基突變為同義突變，外源TRAIL基因可以正確表達.

3討論

TRAIL為腫瘤壞死因子(TNF)超家族的新成員.人的TRAIL基因編碼一種Mr32500的II型跨膜蛋白，該蛋白由281個氨基酸殘基組成.其氨基端位于胞外區，可形成同源二聚體與相應的膜受體結合，介導信號轉導入細胞內，引起細胞凋亡.研究發現，TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡主要通過與其受體結合發揮作用.隨著研究的深入,后來相繼發現了與TRAIL結合的受體共有5種，它們的功能也漸趨清楚［7-8］.其5種受體為：兩種死亡受體即DR4(deathreceptor4)和DR5(deathreceptor5)；兩種誘騙受體即DcR1(decoyreceptorl)和DcR2(decoyreceptor2)；一種可溶性受體骨保護素(osteoprotegerin,OPG)，是調節骨密度有關的受體(regu1atingbonedensityreceptor).DR4和DR5具有TNF受體超家族其它成員類似的胞漿死亡結構域(plasmicdeathdomain)，其與TRAIL特異結合后可通過死亡結構域激發和傳導細胞凋亡信號，激活caspase蛋白酶解級聯反應，導致細胞死亡［9-10］.

腫瘤治療一直是治療性細胞凋亡干預的重要應用領域.TNF和FasL或Fas單克隆抗體很早就被用于腫瘤的治療.它們在體外都能誘導腫瘤細胞迅速凋亡，有效殺傷腫瘤細胞，但皆因嚴重的毒副作用，其中主要是對機體正常細胞的殺傷作用，限制了它們的臨床應用.TRAIL能有效殺傷腫瘤細胞，但其mRNA在組織中的廣泛分布提示它對正常組織細胞可能沒有毒性.研究提示，正常組織細胞因具有TRAIL誘騙受體(decoyrecptor)，能逃避TRAIL的攻擊，而腫瘤細胞不具有這一保護性受體，不能抵御TRAIL的殺傷作用［11］.由于TRAIL誘導凋亡機制不同于TNF，因此對其抗腫瘤作用價值的評價就顯得十分重要.

【參考文獻】

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