慢病毒下的胃癌細(xì)胞論文范文

本站小編為你精心準(zhǔn)備了慢病毒下的胃癌細(xì)胞論文參考范文，愿這些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

1材料與方法

1.1方法

1.1.1STAT3-shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建選擇GenBank提供的STAT3基因序列（NM_139276.2）為靶基因，委托上海紐恩公司設(shè)計(jì)多個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列，結(jié)合設(shè)計(jì)軟件評(píng)估測(cè)定結(jié)果及公司設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)，最終確定并合成shRNA序列：5’-AACTTCAGACCCGTCAACAAA-3’，進(jìn)一步合成雙鏈DNAoligo，退火后與AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切載體pLKD.CMV.G&PR.U6.shRNA連接，轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)長(zhǎng)出的克隆進(jìn)行PCR鑒定，測(cè)序比對(duì)正確后，抽提重組質(zhì)粒，與包裝質(zhì)粒psPAX2、外膜質(zhì)粒pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞完成病毒組裝。離心去除細(xì)胞碎片并用0.45μmPESfilterflask過(guò)濾收集上清液，100000×g，4℃超速離心2h后得到濃縮的STAT3-shRNA病毒液。同法構(gòu)建陰性對(duì)照病毒。進(jìn)一步梯度感染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下計(jì)算綠色熒光蛋白（greenflu－orescentprotein，GFP）數(shù)目，計(jì)算病毒滴度。測(cè)得干擾病毒滴度為：3.80×108Tu/ml，陰性對(duì)照病毒滴度為：6.51×108Tu/ml。

1.1.2細(xì)胞培養(yǎng)用含10％小牛血清、1％的青/鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞，每3天按1∶3的比例傳代。

1.1.3慢病毒轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞實(shí)驗(yàn)共分為3組：實(shí)驗(yàn)組（STAT3-shRNA轉(zhuǎn)染組）、陰性對(duì)照組（空病毒載體轉(zhuǎn)染組）、空白對(duì)照組（正常SGC-7901細(xì)胞）。SGC-7901細(xì)胞按1×106個(gè)/孔均勻接種至6孔板，長(zhǎng)至匯合度為30％～40％時(shí)，加入慢病毒（感染復(fù)數(shù)MOI=20），12h后更換為新鮮的無(wú)病毒培養(yǎng)基。

1.1.4激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）各組細(xì)胞按2×103個(gè)/孔均勻接種至裝有滅菌爬片的24孔板中，48h后棄培養(yǎng)基，PBS溶液洗3次，4%多聚甲醛固定10min，輕輕取出爬片并倒扣于載玻片上，甘油封片后用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.1.5Real-timePCR檢測(cè)STAT3基因表達(dá)收集各組細(xì)胞1×106個(gè)，trizol法抽提總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA純度及濃度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為：42℃60min，95℃5min，5℃5min。取2μlcDNA模板進(jìn)行PCR。STAT3上游引物序列為：5’-GAGGACTGAGCATCGAGCA-3’，下游引物序列：5’-CATGTGATCTGACACCTGAA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)85bp；內(nèi)參引物β-actin上游序列為：5’-CTGGAACGGTGAAGGT－GACA-3’，下游引物序列：5’-AAGGGACTTCCTGTAACAATG－CA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)140bp。PCR反應(yīng)條件：95℃30s，95℃5s及60℃30s共循環(huán)40次。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt公式比較mRNA相對(duì)表達(dá)水平，ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值。

1.1.6Westernblot檢測(cè)STAT3、Bcl-2、survivin及Mcl-1蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞，裂解緩沖液（裂解液∶蛋白酶抑制劑混合物=500∶2）冰上裂解15～20min，4℃、12000r/min離心15min以分離細(xì)胞碎片。BCA蛋白定量法測(cè)蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸至完全變性。50μg總蛋白提取物在10％SDS-PAGE凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜（90V，1.5h）。室溫下用含5％脫脂奶粉的TBST溶液孵育1h以阻斷非特異性結(jié)合，一抗（STAT3稀釋比例為1∶2000，Bcl-2、survivin及Mcl-1稀釋比例為1：200）4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次×5min；二抗（1∶2500）37℃孵育2h，TBST洗膜3次×5min，最后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。應(yīng)用QuantityOne軟件分析圖像，蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度用目的基因條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

1.1.7MTT法分析5-Fu的化療敏感性將細(xì)胞均勻接種至96孔板（5×103個(gè)/孔），貼壁后加入5-Fu至終濃度分別為0、5、10、15、20、50、100μg/ml，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。48h后每孔加20μl5mg/ml的MTT溶液，37℃孵育4h，棄培養(yǎng)基，每孔加150mlDMSO溶液。搖床上震蕩15min，用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處吸光度值（absorbance，A）。以不加5-Fu組作對(duì)照，計(jì)算各組細(xì)胞的增殖抑制率，公式為：增殖抑制率（100％）=[對(duì)照組A570nm－實(shí)驗(yàn)組A570nm]/對(duì)照組A570nm×100%。

1.1.8流式細(xì)胞儀比較細(xì)胞凋亡差異細(xì)胞接種至6孔板，貼壁后加入5-Fu至終濃度為20μg/ml。48h后，收集4×105個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌2遍后用195μlAnnexinV-PE結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5μlAnnexinV-PE（帶紅色熒光），混勻后室溫下避光孵育10min，離心棄上清，加入200μl結(jié)合緩沖液，盡快送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS17.0處理數(shù)據(jù)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示數(shù)據(jù)，以單因素方差分析法比較多組間差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1GFP在SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)慢病毒感染SGC-7901細(xì)胞后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可見實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組均有明顯GFP表達(dá)（圖1）。

2.2STAT3-shRNA轉(zhuǎn)染后STAT3mRNA及蛋白表達(dá)情況Real-timePCR結(jié)果（表1）所示，阻斷STAT3信號(hào)后，STAT3mRNA相對(duì)表達(dá)水平下降為0.46±0.04，明顯低于空白對(duì)照組1.00±0.01、陰性對(duì)照組0.93±0.05（P<0.05）。免疫印跡結(jié)果（圖2、表1）顯示，STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度在空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組中依次為0.78±0.07、0.75±0.05、0.47±0.04，表明STAT3-shRNA可明顯下調(diào)STAT3蛋白活性（P<0.05），而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間無(wú)明顯差異（P=0.528）。

2.3抑制STAT3表達(dá)后SGC-7901細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性MTT結(jié)果（表2）示，與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率明顯升高（P<0.05），表明STAT3-shRNA能抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)5-Fu的化療敏感性。

2.4慢病毒介導(dǎo)shRNA抑制STAT3后細(xì)胞凋亡率的變化抑制STAT3后細(xì)胞凋亡率（39.16±2.25）％，較陰性對(duì)照組（23.43±2.86）％、空白對(duì)照組（23.75±1.23）％明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明抑制STAT3表達(dá)能增強(qiáng)5-Fu的凋亡誘導(dǎo)作用（表3）。

2.5STAT3信號(hào)通路阻斷后抗凋亡蛋白表達(dá)情況Westernblot結(jié)果表明（圖3、表4），Bcl-2、Mcl-1及sur－vivin的蛋白表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組中分別為0.47±0.03、0.35±0.02、0.45±0.02，空白對(duì)照組中為0.81±0.06、0.52±0.05、0.71±0.03，陰性對(duì)照組為0.78±0.07、0.49±0.01、0.67±0.05。與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組上述蛋白水平分別下調(diào)約40％、29％、33％（P<0.05），而兩對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

3討論

5-Fu是胃癌化療的一線藥物，其通過(guò)抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶影響DNA的生物合成，屬于抗代謝類化療藥物，然而其療效往往因癌細(xì)胞獲得多藥耐藥性（multidrugresistance，MDR）而受到極大影響[4]。MDR的形成機(jī)制十分復(fù)雜，耐藥蛋白過(guò)表達(dá)、細(xì)胞凋亡異常、轉(zhuǎn)錄因子活化、藥物代謝異常等皆可誘導(dǎo)MDR。研究證明，化療藥物發(fā)揮細(xì)胞毒性作用的主要機(jī)制是誘導(dǎo)凋亡，可由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)在的抗凋亡程序激活，使得其對(duì)化療藥物耐受，最終導(dǎo)致化療失敗[5]。STAT3作為絡(luò)氨酸信號(hào)通路中的重要轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)控多個(gè)下游靶分子介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化及凋亡。在正常細(xì)胞中，STAT3的活化快速而短暫，而在腫瘤細(xì)胞中STAT3卻能異常的持續(xù)活化，促進(jìn)細(xì)胞不斷增殖，抑制凋亡，誘導(dǎo)腫瘤血管生成及免疫逃逸，最終促進(jìn)腫瘤發(fā)生與發(fā)展。Bcl-2、Mcl-1、survivin均是STAT3通路下游的靶基因，其中Bcl-2及Mcl-1是Bcl-2家族蛋白的主要成員，依賴線粒體途徑抑制促凋亡因子的釋放，抑制細(xì)胞凋亡[6]；survivin則是凋亡抑制蛋白（IAPs）家族成員，主要依賴Caspase途徑抑制細(xì)胞色素C釋放從而抑制凋亡[7]。近來(lái)的研究認(rèn)為，STAT3的異常活化與腫瘤細(xì)胞耐藥有關(guān)，抑制STAT3可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的化療抵抗性。Liu等和Gu等[9]分別在黑色素瘤及頭頸部鱗癌中發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞中STAT3表達(dá)水平較不耐藥細(xì)胞明顯上調(diào)，沉默STAT3可抑制腫瘤生長(zhǎng)，逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞的化療抵抗性。Duan等[10]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染IL-6（STAT3的活性配體）可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥，利用siRNA沉默STAT3可增強(qiáng)紫杉醇的抗腫瘤活性。目前，STAT3沉默對(duì)胃癌細(xì)胞化療敏感性影響的研究相對(duì)甚少，鑒于此，本實(shí)驗(yàn)擬阻斷胃癌SGC-7901細(xì)胞的STAT3信號(hào)通路，觀察5-Fu化療敏感性的變化。

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是利用體外合成的RNA序列特異性地結(jié)合并降解同源目的mRNA，使目的基因功能完全或部分喪失的生物學(xué)過(guò)程，可通過(guò)2種途徑實(shí)現(xiàn)：一種是直接向細(xì)胞轉(zhuǎn)染小干擾RNA（siRNA），另一種則是通過(guò)質(zhì)粒、病毒或細(xì)菌載體將短發(fā)夾RNA（shRNA）傳遞至靶細(xì)胞[11]。siRNA由于存在易被血清核糖核酸酶降解、穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)運(yùn)效率差等不足之處，因此本實(shí)驗(yàn)選擇更加特異、穩(wěn)定的shRNA以抑制靶基因表達(dá)。本研究通過(guò)構(gòu)建靶向STAT3基因的慢病毒載體，介導(dǎo)shRNA轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到明顯的GFP表達(dá)，real-timePCR及免疫印跡結(jié)果表明干擾后STAT3mRNA表達(dá)抑制率約為54％，蛋白水平下降達(dá)40％，說(shuō)明STAT3在基因及蛋白水平均得到有效抑制。MTT及流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)STAT3-shRNA可增強(qiáng)5-Fu的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，提示SGC-7901細(xì)胞對(duì)5-Fu的化療敏感性升高。為了闡明其化療增敏的機(jī)制，進(jìn)一步檢測(cè)了STAT3下游靶分子Bcl-2、Mcl-1、survivin蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)三者的活性均明顯下調(diào)，這與Liu[12]、Wen等[13]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明STAT3-shRNA能通過(guò)抑制STAT3表達(dá)進(jìn)而下調(diào)該通路下游的抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1、survivin的活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，使5-Fu的抗腫瘤活性增強(qiáng)。

總之，慢病毒介導(dǎo)的STAT3-shRNA能靶向抑制SGC-7901細(xì)胞中STAT3基因表達(dá)，通過(guò)阻斷STAT3信號(hào)通路使下游的抗凋亡信號(hào)Bcl-2、Mcl-1、survivin的表達(dá)下降，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在一定程度上提高胃癌細(xì)胞對(duì)5-Fu的化療敏感性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靶向STAT3的基因治療聯(lián)合化療，能逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞對(duì)5-Fu的抵抗性，有可能成為胃癌治療的有效新途徑。但本實(shí)驗(yàn)僅為初步的體外實(shí)驗(yàn)，腫瘤細(xì)胞的耐藥是涉及多種機(jī)制的復(fù)雜過(guò)程，尚需進(jìn)一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

作者：鐘竹周偉吳小翎單位：重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科重慶市腫瘤醫(yī)院放療科