一氧化氮合成酶癌細(xì)胞論文范文

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1方法

1．1細(xì)胞培養(yǎng)GES－1細(xì)胞株用DMEM培養(yǎng)液(10%胎牛血清，1%P/S雙抗，1%HEPES緩沖液)進(jìn)行培養(yǎng);BGC－823和SGC－7901用RPMI－1640培養(yǎng)液(10%胎牛血清，1%P/S雙抗，1%HEPES緩沖液)進(jìn)行培養(yǎng)，在合適的濕度、5%CO2、37℃環(huán)境下行無菌培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞富集度達(dá)到75%左右，用0．25%的胰酶消化成單個細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。

1．2MTT對細(xì)胞增殖的檢測將對數(shù)生長期的GES－1、BGC－823、SGC－7901細(xì)胞計數(shù)后以規(guī)定密度(4×104/mL)均勻接種于24孔(每孔500μL)培養(yǎng)板中，每組設(shè)4個復(fù)孔。培養(yǎng)24h，待細(xì)胞充分貼壁后，將培養(yǎng)液分別更換為含0、0．0001、0．01、1、10、100mmol/L的SNP培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72h后，加入MTT(5g/L)溶液30μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，之后加入400μLFormazan溶解液過夜溶解，待紫色物質(zhì)完全溶解后在酶標(biāo)儀波長570nm處檢測，實(shí)驗重復(fù)3次。

1．3NO測試盒對NO濃度檢測加入MTT之前，每孔取出100μL培養(yǎng)液放入1．5mL離心管內(nèi)，加入NO測試盒內(nèi)的試劑一200μL，混勻，再加入試劑二100μL，充分渦旋振蕩后放置10min，然后離心(4000r/min)15min。取上清液160μL加入96孔板中，按試劑三:試劑四:試劑五為2．5:1:1的比例配成染色劑，在取出的上清液中每孔加入80μL，混勻，放置15min后在酶標(biāo)儀波長550nm處檢測并計算NO濃度。

1．4統(tǒng)計學(xué)分析實(shí)驗數(shù)據(jù)為計量資料，均以mean±SD描述，多組間均數(shù)比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD，運(yùn)用SPSS19．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，檢驗水準(zhǔn)α=0．05，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1外源性NO對胃癌細(xì)胞BGC－823增殖的影響MTT檢測結(jié)果表明，胃癌細(xì)胞株BGC－823在12、24、48、72h加入不同濃度SNP后，與對照組相比，胃癌細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制，且隨著SNP濃度的增高其抑制作用逐漸增強(qiáng)(圖1)。其中對0．0001mm/L濃度組和0．01mm/L濃度組對細(xì)胞增殖的抑制作用在12、24、48h組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而0．01mm/L濃度組在72h時與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)，10mm/L濃度組與100mm/L濃度組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2．2外源性NO對胃癌細(xì)胞SGC－7901增殖的影響MTT結(jié)果表明，胃癌細(xì)胞株SGC－7901在12、24、48、72h加入不同濃度SNP后，與對照組相比，胃癌細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制，且隨著SNP濃度的增高其抑制作用逐漸增強(qiáng)(圖2)。其中0．01mm/L、1mm/L濃度組、10mm/L濃度組、100mm/L濃度組在12、48、72h時對細(xì)胞的增殖作用與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)，而0．01mm/L濃度組在24h時與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。

2．3外源性NO對正常胃粘膜細(xì)胞株GES－1增殖的影響MTT結(jié)果顯示，正常胃粘膜細(xì)胞株GES－1在12、24、48、72h加入不同濃度SNP后，與對照組相比，細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，且隨著SNP濃度的增高其抑制作用逐漸增強(qiáng)(圖3)。其中0．0001mm/L濃度組、0．01mm/L濃度組和1mm/L濃度組在12h時對細(xì)胞的增殖作用與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)，而在24h0．0001mm/L濃度組(P=0．00)、0．01mm/L濃度組(P=0．00)、1mm/L濃度組(P=0．00)與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在48h和72h0．0001mm/L濃度組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其他濃度組對細(xì)胞增殖都有抑制作用。

2．4不同濃度SNP處理BGC－823胃癌細(xì)胞后培養(yǎng)液中NO濃度的檢測運(yùn)用NO濃度檢測試劑盒，檢測酶標(biāo)儀波長550nm處吸收值并計算NO濃度。結(jié)果表明，培養(yǎng)液中NO濃度隨著SNP濃度的增高而增高。

2．5不同濃度SNP處理胃癌細(xì)胞SGC－7901后培養(yǎng)液中NO濃度的檢測運(yùn)用N0測試盒，檢測酶標(biāo)儀波長550nm處吸收值并計算NO濃度，結(jié)果表明，培養(yǎng)液中NO濃度隨著SNP濃度的增高而增高。

2．6不同濃度SNP處理正常胃粘膜細(xì)胞GES－1后培養(yǎng)液中NO濃度的檢測運(yùn)用NO測試盒，檢測酶標(biāo)儀波長550nm處吸收值并計算NO濃度。結(jié)果表明，培養(yǎng)液中NO濃度隨著SNP濃度的增高而增高。

3討論

研究表明，通過基因敲除技術(shù)將一氧化氮合成酶敲除后，小鼠因一氧化氮合成酶表達(dá)缺失而在胚胎時期死亡。NO合成酶的每個異構(gòu)體在不同組織選擇性發(fā)揮不同生物學(xué)功能。如eNOS基因敲除小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的高血壓，主要是因為特定表達(dá)的上皮細(xì)胞中的eNOS在血管形成、增殖中起重要作用。而iNOS缺乏的小鼠容易感染疾病，且在巨噬細(xì)胞抵御病原體與腫瘤細(xì)胞侵襲中顯得功能異常。nNOS基因表達(dá)異常容易導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及信息傳遞方面的缺陷?？梢娨谎趸铣擅傅恼１磉_(dá)與機(jī)體生理和病理學(xué)功能正常實(shí)現(xiàn)有密切聯(lián)系。但是一氧化氮在細(xì)胞功能學(xué)方面的作用一直未能徹底闡明，且有些結(jié)論相互矛盾。如有研究表明，外源性供體產(chǎn)生的NO對細(xì)胞有毒性作用，容易誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡。但是也有結(jié)果顯示，NO可能對細(xì)胞起保護(hù)作用。如腫瘤細(xì)胞獲得性表達(dá)iNOS后，在體外實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞進(jìn)入凋亡，或許這也是其逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)督的機(jī)制之一。本研究利用SNP供體研究外源性NO對兩株胃癌細(xì)胞及正常胃粘膜細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，外源性NO對正常胃粘膜細(xì)胞和胃癌細(xì)胞均有抑制作用(P＜0．05)，且隨著NO濃度的增高其抑制作用逐漸增強(qiáng)。綜上所述，外源性NO對正常胃粘膜細(xì)胞和胃癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用。

作者：解亞麗喬金婉于冬悅趙婧劉永年楊生璽蘇占海單位：青海大學(xué)研究生院中國藥科大學(xué)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部