免疫雞群馬立克病的診斷范文

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《中國獸醫(yī)科學(xué)雜志》2014年第八期

1材料與方法

1．1PCR診斷引物的設(shè)計(jì)與合成：參照GenBank中MDV1強(qiáng)毒株基因的保守區(qū)序列（EU104985），設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，P1：5′－TTCCGAGATCGAAGAAGT－GAG－3′，P2：5′－ACTCTGGTGGCAAGTATCCT－GT－3′，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為567bp。該引物由Invitrogen（北京）公司合成。病料處理：取2g肝組織塊置于平皿中，用400μg／mL雙抗液清洗組織表面數(shù)次，剪碎并放入勻漿器中研磨，加入10mLHank’s液（無Ca2＋、Mg2＋），反復(fù)凍融3次。4℃8000r／min離心20min，吸取上清，用孔徑0．22μm的一次性濾器過濾。隨后，按照DNA提取試劑盒的操作說明書對(duì)病雞肝組織器官內(nèi)的病毒DNA進(jìn)行提取。PCR檢測(cè)：取10×Buffer2．5μL，dNTP2μL（各成分濃度均為2．5mmol／L），TaqDNA聚合酶0．2μL（5U／μL），P11μL（10pmol／μL），P21μL（10pmol／μL），DNA模板1μL（7．75×10－2～7．75×10－5ng／μL），ddH2O17．3μL，置于500μLEP管中。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；94℃變性10s，60℃退火20s，72℃延伸20s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后72℃孵育5min。最終PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1．2病理組織學(xué)觀察對(duì)中性甲醛溶液固定材料進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，蘇木精－伊紅（HE）染色，并進(jìn)行AgNOR核仁區(qū)嗜銀蛋白特殊染色。采用OLYMPUSBX－UCB／BX61型光學(xué)顯微鏡觀察和圖像分析系統(tǒng)分析。

2結(jié)果

2．1瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)8份MDV1標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與分別加有MDV1標(biāo)準(zhǔn)抗原液的陽性對(duì)照孔和待檢抗原液孔間均有清晰的沉淀線，而與加有生理鹽水的陰性對(duì)照孔間均無沉淀線形成，這與預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果一致，證明羽髓中含有MDV1。

2．2PCR診斷PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照（D2）表現(xiàn)為陰性，陽性對(duì)照（D1）和1、2、3、4、5、6、7、8號(hào)病雞組均擴(kuò)增出567bp的MDV1特異性條帶（見圖1）。證明病雞肝組織中含有MDV1，證實(shí)該雞場(chǎng)雞群是由于感染MDV1引起的MD。

2．3病理學(xué)觀察眼觀：8只病雞均表現(xiàn)有精神不振，呆立，羽毛松亂和食欲減退的癥狀，其中6只病雞有下痢和拉青綠色稀糞癥狀。多數(shù)病雞表現(xiàn)肢體神經(jīng)非對(duì)稱性麻痹，蹲伏地上，不能正常行走，有的呈典型的“劈叉”姿態(tài)，有的病雞表現(xiàn)翅膀下垂，頭頸歪斜。8只病雞眼睛虹膜均有單側(cè)或雙側(cè)程度不等的渾濁，瞳孔呈同心環(huán)狀和斑點(diǎn)狀彌漫性灰白色，邊緣不整齊，少部分嚴(yán)重病例表現(xiàn)失明狀態(tài)。8只病雞心臟的外膜下、冠狀溝、心壁和心尖等處均可見單個(gè)或多個(gè)大小不等的灰白色腫塊，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，心肌纖維顏色變淡。其中，5只病雞心臟表面有較大的灰白色腫塊，致心臟發(fā)生變形。8只病雞肝均呈現(xiàn)不同程度的腫大，被膜緊張，質(zhì)脆，表面和實(shí)質(zhì)有彌漫性分布的灰白色粟粒大結(jié)節(jié)病灶，微突出于表面，切面平整。嚴(yán)重病例的肝高度腫大，呈灰白色，占據(jù)體腔大部。8只病雞脾均不同程度腫大（約為正常雞脾的2～5倍），被膜緊張，表面和切面有彌漫性分布的灰白色粟粒大小結(jié)節(jié)病灶，切面平整。8只病雞肺均散在大小不等的灰白色結(jié)節(jié)性病灶，呈局灶性或彌漫性分布；其中有6只病雞肺有較大的灰白色結(jié)節(jié)灶，正常肺結(jié)構(gòu)破壞，病灶質(zhì)地較堅(jiān)748中國獸醫(yī)科學(xué)第44卷實(shí)。8只病雞腎有程度不等腫大，顏色程度不等變淡。8只病雞腺胃胃壁均程度不等腫厚，質(zhì)地較硬，部分病雞胃壁切面有灰白色腫塊。個(gè)別病雞肌胃胃壁也程度不等增厚，質(zhì)地較硬，切面有局灶性和彌漫性分布的灰白色病灶。8只病雞坐骨神經(jīng)均有程度不等的單側(cè)性腫粗，病變坐骨神經(jīng)彈性降低或喪失，色灰白或黃白。其中，3只病雞病變坐骨神經(jīng)部形成大小不等的灰白色串珠狀結(jié)節(jié)。鏡下：8只病雞病變局部變化特征基本一致。病雞各臟器彌漫性和／或局灶性增生的灰白色病灶均由腫瘤化的大小不等的多形態(tài)的大、中、小淋巴細(xì)胞，成淋巴細(xì)胞，漿細(xì)胞，網(wǎng)狀細(xì)胞和MD細(xì)胞組成。腫瘤細(xì)胞核不規(guī)則，并可見大量異常的核分裂相。尤其MD細(xì)胞，體積較大，核有明顯異常分裂相，胞質(zhì)內(nèi)有空泡，呈強(qiáng)嗜堿性，在各病灶區(qū)均有數(shù)量不等的分布。心臟，瘤細(xì)胞可局灶性或彌漫性浸潤于心肌纖維間，周圍心肌纖維變性、壞死，嚴(yán)重時(shí)心肌纖維可被腫瘤細(xì)胞取代（見圖2A）。

作者：孫寶高欣賈寧單位：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院