基因芯片對雞法氏囊差異的表達范文

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《畜牧獸醫學報》2014年第八期

1熒光定量PCR

為驗證芯片的結果，本研究選擇了6個差異表達基因，根據GenBank中的基因序列，通過網絡在線軟件Primer－BLAST（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／tools／primer－blast）設計了幾對特異性引物（引物序列見表1），進行熒光定量PCR，通過2－△△CT進行計算。引物由上海Invitrogen公司合成。RNA樣本中基因組DNA的去除和cDNA合成按照試劑盒（TaKaRa，China）說明書進行操作。熒光定量PCR按照試劑盒（TaKaRa，China）說明書在7500型熒光定量PCR儀（ABI，Singapore）上進行。以3－磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphatedehydrogenase，GAPDH）基因作為內參基因進行數據的標準化處理。反應體系（20μL）：SYBRGreenⅡ（2×）10μL，上下游引物各2μL，ROXⅡ（50×）0．4μL，超純水4．5μL，模板（cD－NA）1．1μL。反應程序：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40個循環。通過Spearman檢驗對基因芯片和RealtimePCR2種方法的結果進行相關性分析。

2結果

2．1法氏囊組織RNA提取質量雞胚或雞法氏囊組織樣本（n＝3）的總RNA經試劑盒提取后，經檢測，所有的總RNA質量均較好（RIN≥7．0，且28S／18S≥0．7，為合格［16］），純度較高。

2．2不同時間點法氏囊組織中基因的檢出率及檢測的變異系數在雞胚18日齡時，基因的檢出率比較高，而10和30日齡時稍低；變異系數（CV）雖然隨著日齡增加，其數值在增加，但其均值均低于10％（表2）。

2．3不同時間點法氏囊組織差異表達基因數差異倍數在2倍及以上且P＜0．05的基因為差異表達基因。比較不同日齡之間雞法氏囊差異表達的基因數目結果見表3。從表3中可以看出，隨著日齡的增加，或者說隨著雞法氏囊發育的完善，差異表達基因數目逐漸減少，如30日齡雛雞與18胚齡雞胚之間比較，有5043個差異基因，10日齡雛雞與18胚齡雞胚之間比較，有2368個差異基因，而30與10日齡雛雞之間比較，有1874個差異基因。其中，在日齡差距比較大時（30日齡雛雞與18胚雞胚之間），下調基因數目比較多，約3120個，而日齡差距較小時，下調基因數目基本沒有變化，約在1330個左右；而上調基因數目有一些減少，從1923個（30日齡雛雞～18胚齡雞胚）降低到1035個（10日齡雛雞～18胚齡雞胚），再降到544個（30～10日齡雛雞）。

2．4差異表達基因GO功能分類分析對差異表達基因進行GO（GOontology）功能分類，如圖1所示。在分子功能方面，有9．97％（236／2368）～10．07％（508／5043）的差異基因參與結合功能，有3．73％（188／5043）～4．6％（109／2368）的差異基因參與催化功能，而僅在30日齡雛雞與18胚齡雞胚比較時有0．02％（1／5043）～1．84％（93／5043）的差異基因參與了抗氧化活性、轉錄調節、酶調節、分子轉導等的功能。在細胞組成方面，有7．59％（383／5043）～8．75％（164／1874）的差異基因參與細胞組成，3．51％（177／5043）～4．11％（77／1874）的差異基因參與細胞器組成，1．81％（34／1874）～2．54％（60／2368）的差異基因參與胞外區組成，而僅在30日齡雛雞與18胚齡雞胚比較時約有0．2％（10／5043）的差異基因參與了突觸的功能。在生物學加工方面，有5．02％（941874）～5．83％（138／2368）的差異基因參與代謝過程，8．22％（154／1874）～8．36％（198／2368）的差異基因參與細胞加工，2．08％（39／1874）～3．03％（153／5043）的差異基因參與發育加工過程，4．27％（80／1874）～5．14％（259／5043）的差異基因參與生物學調節過程，0．48％（9／1974）～0．67％（34／5043）的差異基因參與免疫系統加工過程，而僅在10日齡雛雞與18胚齡雞胚比較時約有0．38％的差異基因參與多個生物過程，而僅在30日齡與18胚齡比較時有0．02％（1／5043）～0．1％（5／5043）的差異基因參與了細胞殺傷、色素沉積等功能。

2．5差異表達基因的信號通路分析對差異表達基因通過KEGG數據庫進行信號通路分析，富集檢測的P＜0．05的信號通路總共有36條（表4）。其中10日齡雛雞與18胚齡雞胚之間的差異基因涉及到21條信號通路，獨有的信號通路有9條；30與10日齡雛雞之間的差異基因涉及到12條信號通路，獨有的信號通路有4條；30日齡雛雞與18胚齡雞胚之間的差異基因涉及到23條信號通路，獨有的信號通路有8條；差異基因涉及到共同的信號通路有5條。

2．6差異基因的熒光定量PCR驗證為驗證基因芯片所篩選的差異表達基因，隨機選取了6個基因（30日齡雛雞～18胚齡雞胚），以GAPDH為參照基因，用熒光定量PCR的方法進行了驗證。2種檢測方法的結果通過Spearman檢驗進行相關分析，結果Spearman相關系數r＝0．9429，P＝0．0167，說明基因芯片中差異表達基因的表達變化情況與熒光定量PCR驗證的結果是一致的（表5）。

3討論

法氏囊在胚胎時期就開始發育，在雛雞出殼后發育迅速，免疫性能逐步完善。在這個過程中，基因組的序列并沒有發生變化，但其表達呈有序的時空變化，這種變化在轉錄組水平上得到體現。轉錄組的有序變化調控著機體的生命活動。因此，對轉錄組進行研究，有望為組織的發育與功能研究進行理論和方法學的探索。本研究通過基因表達譜芯片技術探討了雞法氏囊發育過程中轉錄組的變化，得到了法氏囊發育相關的大量的基礎信息，為深入研究法氏囊發育的分子機制提供了依據。白細胞介素（interleukin，IL）調節免疫細胞的活化、分化和增殖，與其受體結合后調節免疫反應。在本研究中，IL1B、IL6、IL7、IL8、IL15和IL17D等被鑒定為差異表達基因。IL6是一種具有抗炎作用的細胞因子，IL7有利于B細胞的增殖［18］。IL8是一種趨化因子，可以趨化中性粒細胞和嗜堿性粒細胞，進而引發炎癥反應和過敏反應。在本研究中，IL6、IL7和IL8呈下調表達。這表明，隨著法氏囊發育成熟，IL6的抗炎作用、IL8引發炎癥的能力和IL7調節B細胞增殖的作用逐漸下降。IL1B可以促進T和B細胞的生長與分化，本研究中IL1B早期呈上調表達，表明IL1B是在法氏囊發育早期促進淋巴細胞的發育。信號通路通過受體結合將細胞外信號傳遞到細胞內引發一系列的生理或病理反應。在本研究中，TLR信號通路和NLR信號通路被富集為顯著的信號通路。差異表達基因如CCL5（chemokine（C－Cmotif）ligand5）、CD80、IL1B、MAP2K4（mitogen－activatedproteinkinasekinase4）、MAPK11（mito－gen－activatedproteinkinase11）和SPP1（secretedphosphoprotein1）等可能通過Toll樣受體信號通路參與了法氏囊的發育，差異表達基因如CCL5、IL1B、IL6、MAPK11、PSTPIP1（proline－serine－threoninephosphataseinteractingprotein1）和TRAF6（TNFreceptor－associatedfactor6）等涉及到了核苷酸寡聚化域樣受體信號通路。而NLR和TLR是機體重要的病原識別的信號通路，引起抗微生物感染的天然免疫應答。在本研究中，法氏囊發育早期，有差異基因涉及到這2個信號通路，而到法氏囊發育后期，沒有差異基因涉及到這2個信號通路。雞在免疫系統尚未發育完善時受到病原感染后，宿主的先天免疫功能來不及發揮作用，進而發展為疾病。共黏連信號通路（focaladhesionsignalingpathway）在維持正常細胞結構中具有重要功能。在本研究中，一些編碼膠原成分的差異表達基因如Col1A2（collagen，typeI，alpha2）、Col3A1、Col4A1、Col4A2、Col5A1、Col5A2、Col6A1、和Col6A3等涉及到共黏連信號通路。膠原是細胞外基質的主要結構成分。4型膠原（由Col4A1和Col4A2組成）是基底膜（包括血管壁）的重要成分，Col4A1在胚胎發育過程中基底膜形成時為其他整合成分提供支架［24］。Col5A1是許多結締組織中Ⅰ型富含膠原纖維的成分，可以調節由Ⅰ和Ⅴ型膠原組成的其他類型纖維的直徑。Col6A1是微型纖維的結構成分，參與了細胞遷移、分化和胚胎發育［26］。其它一些參與共黏連信號通路的差異表達基因在法氏囊發育方面可能也發揮了一些作用，如ITGA9（integrin，alpha9）對淋巴管瓣形成是必須的，ITGB5（integrin，beta5）參與了細胞黏附和整合信號的傳導，LAMA1（laminin，alpha1）是層黏連蛋白111的主要成分，而層黏連蛋白111在基底膜形成中有重要作用［29］。雞法氏囊的發育是一個復雜的過程，很多的基因和蛋白參與了這個過程。本研究初步探討了法氏囊發育過程中基因表達的變化，為研究相關基因在法氏囊發育過程中所起的作用提供了理論依據，相關差異基因的蛋白質水平變化還有待進一步深入研究。

作者：杭柏林 桑建君錢琨葉建強邵紅霞金文杰梅梅繆佶秦愛建單位：揚州大學獸醫學院河南科技學院動物科學學院