乳腺癌相關(guān)基因臨床應(yīng)用價值的探討范文

本站小編為你精心準(zhǔn)備了乳腺癌相關(guān)基因臨床應(yīng)用價值的探討參考范文，愿這些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

摘要：目的探討熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ－PCR）法檢測外周血mRNA中B細(xì)胞淋巴瘤／白血病－2基因（BCL－2）、細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）、黏蛋白1（MUC1）、原癌基因人類表皮生長因子受體2（HER－2）和人乳腺珠蛋白（hMAM）5種乳腺癌相關(guān)基因在乳腺癌診斷中的應(yīng)用。方法FQ－PCR法測定50例健康女性體檢者（健康對照組）、92例良性乳腺疾病患者（良性乳腺疾病組）和196例乳腺癌患者（乳腺癌組）外周血mRNA中CCND1、BCL－2、MUC1、HER－2和hMAMmRNA的表達(dá)量。結(jié)果CCND1、BCL－2、MUC1、HER－2和hMAMmRNA表達(dá)水平在乳腺癌組顯著高于健康對照組和良性乳腺疾病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），其在健康對照組和良性乳腺疾病組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；5種基因mRNA在健康對照組和良性乳腺疾病組及乳腺癌組的Ⅰ期的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），而乳腺癌組的Ⅱ期和Ⅲ＋Ⅳ期則顯著高于健康對照組、良性乳腺疾病組和乳腺癌組的Ⅰ期組的陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。結(jié)論采用FQ－PCR技術(shù)檢測乳腺癌mRNA時，應(yīng)考慮到質(zhì)量控制、mRNA水平和異質(zhì)性、腫瘤不同階段等各個方面的因素，才能有效正確地將乳腺癌相關(guān)基因用于乳腺癌的診斷、治療和預(yù)后。

關(guān)鍵詞：熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)；BCL－2；CCND1；MUC1；HER－2；hMAM；乳腺癌

乳腺癌在女性惡性腫瘤發(fā)病率中排名第一，越來越多的乳腺癌相關(guān)基因成為研究熱點(diǎn)，人們期望通過對相關(guān)基因的檢測，及時準(zhǔn)確地為乳腺癌診斷、治療和預(yù)后提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ－PCR）法檢測乳腺癌外周血mRNA是近年來報道較多的研究方法，但是，縱觀國內(nèi)外FQ－PCR對乳腺癌外周血mRNA的報道，其陽性率差別較大［1－2］，因此，本文采用FQ－PCR法檢測了目前研究得較多的，也是乳腺癌密切相關(guān)較為重要的5種基因———B細(xì)胞淋巴瘤／白血病－2基因（BCL－2）、細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）、黏蛋白1（MUC1）、原癌基因人類表皮生長因子受體2（HER－2）和人乳腺珠蛋白（hMAM）［3－6］在健康體檢者、良性乳腺疾病患者和乳腺癌患者的外周血mRNA表達(dá)，目的在于探討FQ－PCR檢測乳腺癌相關(guān)基因在外周血mRNA對乳腺癌診斷的臨床應(yīng)用價值。

1資料與方法

1．1一般資料

選取本院健康女性體檢者50例作為健康對照組，年齡21～86歲，平均46．7歲。另選取本院門診和住院乳腺疾病患者288例，年齡21～87歲，平均45．3歲，經(jīng)病理學(xué)確診，均為初診者。其中良性乳腺疾病患者（良性乳腺疾病組）92例，年齡23～79歲，平均43．6歲；脂肪瘤51例，纖維瘤41例，排除患其他腫瘤的可能性。乳腺癌患者（乳腺癌組）196例，平均年齡47．8歲（23～87歲），具體的臨床病理學(xué)特征見表1。乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《惡性腫瘤TNM分類法》和美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）標(biāo)準(zhǔn)。所有患者均于手術(shù)前1周內(nèi)取晨血5mL。

1．2試劑與儀器

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、β－actin內(nèi)參、FQ－PCR體系、7500SequenceDetector分析儀購自美國ABI公司；cDNA標(biāo)準(zhǔn)品由上海生工公司合成。

1．3方法

1．3．1FQ－PCR引物和探針

采用PE公司PrimerExpress軟件設(shè)計引物和探針，由上海生工公司合成。BCL－2正義引物5′－ACCCCCACTGAAAAAGATGA－3′，BCL－2反義引物5′－ATCTTCAAACCTCCATGATG－3′；CCND1正義引物5′CCTCCTCGCACTTCTGTTCCTCGCAGACCT－3′，CC－ND1反義引物5′－CCAGCATCCAGGTGGCGACGATCTTCCG－3′；MUC1正義引物5′－CGTCGTGGACATTGATGGTACC－3′，MUC1反義引物5′－GGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA－3′；HER－2正義引物5′－GGCTCTCACACTGATAGACACC－3′，HER－2反義引物5′－TCCCCAGCAGCGGGAGCCCTTAC－3′；hMAM正義引物5′－GAGTTCATAGACGACAATGCC－3′，hMAM反義引物5′－CCGTAGTTGGTTTCTCACCAT－3′，β－actin正義引物5′－CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT－3′，β－actin反義引物5′－AGCACTGTGTTGGCGTACAG－3′。

1．3．2FQ－PCR

（1）采用異硫氰酸胍－酚－氯仿一步法提取細(xì)胞總RNA：取靜脈血5mL（1mg／mLED－TA抗凝），生理鹽水稀釋2～3倍，分離淋巴細(xì)胞。（2）cDNA合成：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20μL，其中隨機(jī)引物200ng，RNasin20U，M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶20U，5×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4μL，細(xì)胞總RNA1μg。42℃反應(yīng)50min。（3）PCR：MgCl25mmol／L，反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μL，寡聚核苷酸引物各為400nmol／L，dCTP、dATP和dGTP各200μmol／L，dUTP400μmol／L，10×緩沖液5μL，尿嘧啶N－糖基化酶（UNG）0．5U，探針150nmol／L，TaqDNA聚合酶1．25U。在7500SequenceDetector分析儀上測定標(biāo)本中CCND1、BCL－2、MUC1、HER－2、hMAM和β－ac－tin含量。擴(kuò)增參數(shù)為：50℃2．5min，95℃12min；94℃30s，66℃1min，42個循環(huán)。1．3．3陽性率的計算［7－8］應(yīng)用2－ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達(dá)量（Ct為循環(huán)閾值）。ΔCt值＝目的基因Ct值－β－actin基因Ct值，以β－actin為內(nèi)參；ΔΔCt＝乳腺癌組的ΔCt值－健康對照組的ΔCt值健康對照組的基因相對表達(dá)量為1．002±0．079，2－ΔΔCt值為乳腺癌組基因相對健康對照組基因表達(dá)的倍數(shù)，測定值以2－ΔΔCt＞2為表達(dá)陽性。

1．4統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS16．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組符合正態(tài)分布的計量資料比較采用方差分析，兩組間比較用采用LSD－t檢驗(yàn)。取檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1各組5種基因mRNA相對表達(dá)水平比較

健康對照組和良性乳腺疾病組間5種基因mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），而乳腺癌組上述指標(biāo)均高于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。

2．2各組5種基因mRNA陽性表達(dá)情況比較

5種基因mRNA在健康對照組和良性乳腺疾病組及乳腺癌組的Ⅰ期的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），而乳腺癌組的Ⅱ期和Ⅲ＋Ⅳ期則顯著高于健康對照組和良性乳腺疾病組的陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。2．35種基因mRNA對乳腺癌診斷性能評價5種基因?qū)θ橄侔┑撵`敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分析結(jié)果見表4，綜合評價各項指標(biāo)，HER－2的靈敏度較高，BCL－2的特異性較強(qiáng)。

3討論

隨著對乳腺癌分子水平的深入研究，人們采用各種方法檢測不同來源乳腺癌相關(guān)基因的表達(dá)。比如，應(yīng)用免疫細(xì)胞學(xué)法從蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測，應(yīng)用分子生物學(xué)方法從組織或外周血進(jìn)行基因水平（DNA和RNA）檢測等。其中FQ－PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針進(jìn)行核酸定量分析的先進(jìn)方法，能同時進(jìn)行擴(kuò)增和檢測［9］，其具有靈敏度高、特異性較強(qiáng)、操作簡單、不需采用強(qiáng)誘變劑等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于外周血中乳腺癌基因mRNA的檢測。BCL－2、CCND1、MUC1、HER－2、hMAM是乳腺癌常用的腫瘤標(biāo)志物，也是近年來報道得較多的乳腺癌相關(guān)基因。筆者查閱資料發(fā)現(xiàn)，采用FQ－PCR檢測乳腺癌mRNA相關(guān)基因的報道存在陽性率差別較大的問題［8，10－11］。本研究檢測196例乳腺癌患者和92例良性乳腺疾病患者外周血hMAM表達(dá)率分別為22．0％和6．0％，而陳月鳳等［10］檢測47例乳腺癌和45例乳腺良性腫瘤外周血hMAM表達(dá)率分別為65．96％和42．22％，顏蘊(yùn)文等［11］檢測40例乳腺癌患者h(yuǎn)MAM陽性率55％，OBERMAYR等［12］檢測38例乳腺癌復(fù)發(fā)患者外周血中hMAM基因表達(dá)陽性率為38．7％。本研究檢測196例乳腺癌外周血MUC1陽性率為21．0％，STRATI等［9］檢測51例轉(zhuǎn)移性乳腺癌的外周血MUC1陽性率為45．1％，CHENG等［13］檢測34例轉(zhuǎn)移性乳腺癌外周血MUC1mRNA化療前后的陽性率分別為88．2％和70．6％。本研究檢測70例早期乳腺癌外周血HER－2陽性率為8．6％，中晚期陽性率為19．4％，PAGE等［8］在檢測68例早期和30例轉(zhuǎn)移乳腺癌外周血HER－2表達(dá)陽性率分別為11．8％和16．7％，BECHMANN等［14］檢測50例早期乳腺癌患者外周血HER－2的表達(dá)陽性率為18．0％，均存在較大的差異。分析原因可能有以下幾點(diǎn)［15］：（1）mRNA的水平：在早期乳腺癌外周血中mRNA水平較低，而中晚期乳腺癌mRNA水平才大量升高；（2）mRNA本身的異質(zhì)性：不同的乳腺癌相關(guān)基因定位了mRNA不同基因位點(diǎn)，使得陽性率產(chǎn)生差異；（3）內(nèi)源性或外源性因素：比如樣品保存、分離、提取和cDNA的制備等；（4）缺乏質(zhì)量控制：目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的FQ－PCR檢測mRNA的質(zhì)量控制系統(tǒng)，這也是造成陽性率差異大的主要原因；（5）方法本身的局限性，如假陰性或假陽性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCL－2、CCND1、MUC1、HER－2、hMAM5種基因表達(dá)水平在健康對照組和良性乳腺疾病組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），而乳腺癌組均高于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。對五種基因和乳腺癌臨床病理因素關(guān)系的分析發(fā)現(xiàn)，五種基因mRNA在健康對照組和良性乳腺疾病組及乳腺癌組Ⅰ期的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），在乳腺癌組中，腫瘤大小、ER、PR和HER－2比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），Ⅱ期、Ⅲ＋Ⅳ期組和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于Ⅰ期組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），說明級別越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌的基因表達(dá)越強(qiáng)烈。綜合評價5種基因?qū)θ橄侔┑撵`敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分析結(jié)果，HER－2的靈敏度較高，BCL－2的特異性較強(qiáng)。

4結(jié)論

由于本研究所選用的基因和研究樣本量的局限，還不能對這5種乳腺癌相關(guān)基因在mRNA的表達(dá)能否用于乳腺癌的早期診斷和治療的問題做出肯定或否定的回答，但Ⅱ期顯著高于健康對照組和良性乳腺疾病組，說明乳腺癌相關(guān)基因檢測對中早期乳腺癌診斷還是有一定意義的。本研究通過對5種基因在健康對照組、良性乳腺疾病組和乳腺癌不同病理學(xué)階段陽性率的比較分析，提示當(dāng)乳腺癌處于中晚期，若能采用嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制，F(xiàn)Q－PCR檢測mRNA可為臨床提供具有一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，但對早期乳腺癌的診斷價值，還值得商榷，這與國外的相關(guān)報道也是一致的［1，16］。在使用FQ－PCR檢測乳腺癌mRNA時，還應(yīng)考慮到質(zhì)量控制、mRNA水平和異質(zhì)性、腫瘤的不同階段等各個方面的因素，才能有效正確地將乳腺癌相關(guān)基因用于乳腺癌的診斷、治療和預(yù)后。

作者：余修中1，歐華1，劉懷莉1，鄧君2單位：1．新津縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，2.．四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院／四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科