維生素C對(duì)免疫細(xì)胞功能的影響范文

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《免疫學(xué)雜志》2016年第二期

[摘要]

目的通過(guò)研究VC處理過(guò)的DC細(xì)胞在過(guò)繼免疫T細(xì)胞培養(yǎng)中是否發(fā)揮促進(jìn)作用，進(jìn)一步探討維生素C對(duì)于免疫調(diào)控的作用機(jī)制，同時(shí)為制備非特異性CTL提供方法及思路。方法采集健康志愿者外周血50ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血PBMC，貼壁后獲得單核細(xì)胞。用VC對(duì)DC進(jìn)行孵育（24h）后經(jīng)PBS洗滌，培養(yǎng)5d后與添加anti-CD3+單抗的T細(xì)胞混合培養(yǎng)至第12天，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組（noneDC組、0mmol/LVC-DC組）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子分泌情況。LDH法檢測(cè)VC對(duì)DC-T細(xì)胞非特異性殺傷情況。結(jié)果VC處理的DC細(xì)胞可顯著刺激T細(xì)胞成熟，其CD8+CD28+及CD40L表型有顯著升高（61.23%±6.78%，68.87%±4.37%），同時(shí)發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞明顯降低（4.51%±1.22%）。細(xì)胞因子分泌情況分析結(jié)果顯示，vcDC可促進(jìn)T細(xì)胞因子分泌，IFN-γ、IL-2有顯著升高（32.29%±3.26%，19.66%±4.37%），IL-4有顯著降低（3.36%±1.29%）。殺傷結(jié)果顯示對(duì)不同腫瘤細(xì)胞非特異性殺傷有明顯增強(qiáng)。結(jié)論VC通過(guò)致敏DC進(jìn)而可激活T細(xì)胞向非特異性CTL（CD8+CD28+）分化，提高T細(xì)胞因子分泌能力。

[關(guān)鍵詞]

維生素C；樹(shù)突狀細(xì)胞；T細(xì)胞亞群；非特異性T淋巴細(xì)胞毒性效應(yīng)

維生素C是一種有效防止氧化損傷的抗氧化劑，可清除細(xì)胞內(nèi)氧化自由基（O-）[1]。生理范圍下，維生素C在血清中的含量一般在70~100μmol/L。研究顯示，靜脈注射3g維生素C，其受注者血清中VC的含量可達(dá)到1700μmol/L，但是如果患者口服相同劑量，血液中VC含量?jī)H達(dá)220μmol/L[2]。我課題組前期研究顯示，高濃度VC可致敏DC細(xì)胞成熟，且當(dāng)VC為1mmol/L時(shí)對(duì)DC細(xì)胞刺激效果最佳，顯著提升DC細(xì)胞的成熟度及表面標(biāo)志物比例。據(jù)研究顯示VC可作為一種抗腫瘤前體物質(zhì)調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制生長(zhǎng)，大劑量的VC（約5mmol/L）可引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，當(dāng)黑色素瘤細(xì)胞B16F10暴露在VC中時(shí)[3-4]，VC可引起細(xì)胞色素C釋放進(jìn)而引起線(xiàn)粒體酶減少。還有研究顯示，VC可通過(guò)下調(diào)CD71（轉(zhuǎn)鐵蛋白）的表達(dá)進(jìn)而降低細(xì)胞對(duì)金屬離子（鐵離子）的攝入，后者被認(rèn)為是維持腫瘤細(xì)胞活性必要的因素之一[5]；而低劑量的VC（小于1mmol/L），又可通過(guò)調(diào)節(jié)Chk2-p53-p21Waf1/Cip1途徑以及影響細(xì)胞膜上受體生長(zhǎng)因子，如胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）-1等來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖[6]。同時(shí)，對(duì)于VC的抗腫瘤機(jī)制又有了新的發(fā)現(xiàn)，VC可以通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)而抑制腫瘤血管生成[6]。而另?yè)?jù)Chen等[7]研究認(rèn)為VC抗腫瘤機(jī)制可能是VC會(huì)釋放游離過(guò)氧化氫，直接作用于腫瘤細(xì)胞DNA干擾腫瘤細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但VC作為免疫調(diào)控物質(zhì)的研究卻鮮有報(bào)道。Hwang等[8]研究顯示，VC可顯著刺激CD4+T細(xì)胞分化，并提高Th1型細(xì)胞比例，同時(shí)釋放大量IL-12，而據(jù)其另一篇報(bào)道顯示[1]，VC還可提高CD8+memoryT細(xì)胞比例。但VC在過(guò)繼免疫細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中如何發(fā)揮作用尚未有所報(bào)道，本文就VC致敏處理過(guò)的DC細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，并對(duì)T細(xì)胞亞群變化及細(xì)胞因子變化等情況進(jìn)行分析。

1材料與方法

1.1試劑耗材維生素C（VC）（Sigama公司），RhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α（Peprotech公司），10%胎牛血清（杭州四季青），RPMI1640（Scientific公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記CD86mAb、PE標(biāo)記CD80mAb、APC標(biāo)記MHC-IIDR、FITC標(biāo)記CD40mAb、PE標(biāo)記CD40L（CD154）mAb（BD公司）。Ficoll分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）。

1.2儀器設(shè)備倒置顯微鏡（奧林巴斯），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo），臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘智），臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppondorf），流式細(xì)胞儀（BD公司），生物安全柜（新加坡ESCO）。

1.3細(xì)胞分離采集健康志愿者外周血50ml與PBS溶液按照1∶4混合均勻，將稀釋后的血液以1∶1比例緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液上方。于4℃、700g離心15min。小心吸取單個(gè)核細(xì)胞層，加入另一離心管中，并用4倍體積PBS洗滌250g離心5min，去除淋巴細(xì)胞分離液。PBS洗滌2次即獲得外周血單核細(xì)胞。

1.4DC細(xì)胞培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞懸浮于1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×108/ml，于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板上貼壁。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~6h貼壁后，收集懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞PBS蕩洗2次后為DC前體細(xì)胞，于倒置顯微鏡下觀(guān)察計(jì)數(shù)，加入1640培養(yǎng)基：GM-CSF（800U/ml）和IL-4（1000U/ml），調(diào)整細(xì)胞數(shù)約為1×106/ml并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞分離貼壁后，收集未懸浮細(xì)胞于1640培養(yǎng)基中（10%FBS），調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107/ml，加入到包被有anti-CD3+單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.6不同濃度VC對(duì)DC的影響于DC孔板細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度VC，濃度梯度為0、50、500μmol/L、5mmol/L。DC細(xì)胞貼壁洗滌后，加入上述濃度VC（RPMI-1640，10%FBS,GM-CSF800U/ml和IL-41000U/ml）孵育24h后洗滌，之后加入培養(yǎng)液RPMI-1640、10%FBS、GM-CSF800U/ml和IL-41000U/ml培養(yǎng)。于第5天將DC與T細(xì)胞混合培養(yǎng)至第14～15天。

1.7T細(xì)胞增殖、表型及細(xì)胞因子分泌水平檢測(cè)不同濃度VC處理的DC細(xì)胞于第5天與T細(xì)胞（1×107）混合，混合比例1∶10，連續(xù)培養(yǎng)至第20天，期間在第5、10、15、20天檢測(cè)T細(xì)胞數(shù)量并作分析。于第15天檢測(cè)細(xì)胞表型，用Percp-CD3mAb、FITC-CD4mAb、APC-CD8mAb、PE-CD28mAb、APC-CD25mAb/CD127mAb、PE-CD40L（CD-154）mAb標(biāo)記T細(xì)胞30min。之后用流式細(xì)胞檢測(cè)儀進(jìn)行表型檢測(cè)。檢測(cè)CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ水平。

1.8LDH法檢測(cè)vcDC-T對(duì)腫瘤細(xì)胞株殺傷活性復(fù)蘇腫瘤細(xì)胞株k562、A549、DLD1，調(diào)整細(xì)胞數(shù)，以不同效靶比與T細(xì)胞混合，室溫下殺傷4h，LDH法檢測(cè)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞株殺傷能力。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS21軟件，兩樣本均數(shù)的比較采用配對(duì)的t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)的比較采用方差分析，方差不齊用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1vcDC可促進(jìn)T細(xì)胞增殖我課題組之前研究結(jié)果顯示，VC可顯著提高DC細(xì)胞表面共刺激分子及CD40表達(dá)，并且隨著VC的濃度呈現(xiàn)梯度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性，且濃度為1mmol/L時(shí)VC對(duì)DC細(xì)胞的刺激作用最明顯，培養(yǎng)最佳時(shí)間為3d。因此本實(shí)驗(yàn)VC濃度為1mmol/L（0mmol/LVC組及無(wú)DC組為空白對(duì)照組），處理DC24h后經(jīng)PBS洗滌2次，更換至1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)5d。與T細(xì)胞混合連續(xù)培養(yǎng)至第20天，T細(xì)胞增殖曲線(xiàn)（圖1a）結(jié)果顯示，在CD3+單克隆抗體存在的前提下，T細(xì)胞有顯著增殖，但由VC-DC引起的T細(xì)胞增殖并不明顯（P>0.05）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而在CD3+單克隆抗體不存在時(shí)，檢測(cè)到T細(xì)胞增殖可受VC影響（圖1b）（P<0.05），結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示VC確實(shí)可通過(guò)激活DC細(xì)胞進(jìn)而刺激T細(xì)胞增殖。

2.2vcDC可促進(jìn)CD8+CD28+T細(xì)胞增殖及CD40L表達(dá)將DC細(xì)胞與T細(xì)胞混合培養(yǎng)至第15天，檢測(cè)T細(xì)胞CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD8+CD28+及CD40L表型。圖2結(jié)果顯示，3組中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+沒(méi)有顯著差異，這很可能因?yàn)閍nti-CD3+單克隆抗體的添加使得CD3+T細(xì)胞被顯著刺激，且T細(xì)胞亞群中主要以CD3+CD8+亞群為主（80.4±%3.32%），但同時(shí)結(jié)果顯示CD40L、CD8+CD28+比例卻有顯著不同，表現(xiàn)為VC-DC組二者有顯著提高。本課題組之前研究已證明，VC除可顯著提高DC細(xì)胞表型外還可有效刺激CD40表達(dá)，而當(dāng)DC與T細(xì)胞混合后CD40可激活T細(xì)胞表面CD40L表達(dá)（68.87%4.37%）同時(shí)活化T細(xì)胞CD8+CD28+比例提高（61.23%±6.78%）。

2.3vcDC可顯著降低CD4+CD25+CD127lo/-(Treg)細(xì)胞比例為考察負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg）亞群表達(dá)情況，本文檢測(cè)了CD4+CD25+CD127lo/-細(xì)胞比例，圖3結(jié)果顯示，VC-DC組Treg比例明顯降低，說(shuō)明VC-DC可降低T細(xì)胞亞群中負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞分化。

2.4vcDC與T細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著提高CD3+CD8+細(xì)胞因子分泌能力經(jīng)anti-CD3mAb激活的T細(xì)胞，其亞群中主要以CD3+為主，其中CD3+CD8+比例占到80%以上，因此我們考察了VC濃度為0.5mmol/L時(shí)DC誘導(dǎo)CD3+CD8+細(xì)胞亞群分泌細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ表達(dá)比例。流式結(jié)果顯示，VC-DC組T細(xì)胞中CD3+CD8+細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力明顯高于未經(jīng)處理的DC組（圖4a、b），表明VC可通過(guò)致敏DC進(jìn)而激活T細(xì)胞，刺激非特異性CTL產(chǎn)生。之后我們做了不同濃度VC對(duì)DC-T細(xì)胞因子誘導(dǎo)情況分析，結(jié)果顯示，在VC的生理濃度范圍內(nèi)（0.05～2mmol/L），VC可顯著刺激DC成熟（此部分研究結(jié)果已發(fā)表），進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞提高細(xì)胞因子分泌能力（圖4c），而當(dāng)VC濃度顯著過(guò)高時(shí)，表現(xiàn)出一定程度的細(xì)胞毒性效應(yīng)（圖3c，5mmol/LVC-DC組）。這也提示我們，VC的用量并非越大越好，高濃度大劑量VC的使用可能會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)造成一定程度的危害。

2.5vcDC可提高T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性為考察VC-DC組與未處理DC組混合培養(yǎng)的T細(xì)胞對(duì)不同種類(lèi)腫瘤細(xì)胞株殺傷能力。選擇效靶比20∶1，殺傷時(shí)間4h。殺傷結(jié)果顯示（圖5），VC-DC組T細(xì)胞殺傷活性有所提高，上述結(jié)果說(shuō)明，VC作為一種重要的功能性小分子物質(zhì)，在免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用，而對(duì)于過(guò)繼免疫細(xì)胞治療，特別是以DC為誘導(dǎo)的DC-T細(xì)胞治療，VC可通過(guò)快速誘導(dǎo)DC成熟，刺激DC表面二類(lèi)分子活化，促進(jìn)CD40表達(dá)，進(jìn)而激活T細(xì)胞，使得非特異性CTL效應(yīng)顯著提高。

3討論

維生素是人體必需的一族小分子化合物，在機(jī)體的發(fā)育、生長(zhǎng)、細(xì)胞分化等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中以維生素C最具代表[9]。維生素C又稱(chēng)抗壞血酸，是一類(lèi)具有強(qiáng)還原效應(yīng)的維生素，對(duì)機(jī)體內(nèi)保持細(xì)胞氧化-還原微環(huán)境的平衡、抵抗氧自由基（O-）[10]起到關(guān)鍵作用。研究顯示，氧化還原作用（Redox）[10-11]對(duì)機(jī)體生理學(xué)效應(yīng)非常顯著，而在炎癥誘導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境[12]中也起到至關(guān)重要的作用，這包括炎癥的發(fā)生，慢性炎癥導(dǎo)致的組織癌變[12]，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，腫瘤抗原二聚化（多聚化）對(duì)腫瘤細(xì)胞免疫原性的調(diào)節(jié)，免疫防御系統(tǒng)的調(diào)控等諸多方面[13-14]。

維生素C作為一種機(jī)體必須的小分子活性物質(zhì)，發(fā)揮重要作用是人體必須的一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9]。研究顯示，VC具有一定的抗腫瘤效應(yīng)，這包括VC直接對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制、凋亡影響，但前提是在高濃度VC的情況下[2,10]；而另一方面，VC可調(diào)控機(jī)體免疫系統(tǒng)[15]，近年來(lái)以VC為基礎(chǔ)的免疫調(diào)控機(jī)制研究越來(lái)越受到研究學(xué)者的重視，并且取得了顯著成果。VC可促進(jìn)T細(xì)胞成熟，并且促使CD4+T細(xì)胞向Th1型增殖、分化的同時(shí)，研究學(xué)者還發(fā)現(xiàn)VC可促進(jìn)CD3+CD8+T細(xì)胞記憶功能的提升[16]，而上述免疫調(diào)控反應(yīng)卻是以DC細(xì)胞為基礎(chǔ)的，即VC通過(guò)調(diào)控DC功能進(jìn)而影響T細(xì)胞分化（直接用VC影響T細(xì)胞沒(méi)有上述調(diào)節(jié)功能）。我課題組前期研究結(jié)果顯示（已接收），VC可顯著提升DC細(xì)胞表面CD80、CD86、HLA-DR表達(dá)，同時(shí)我課題組還發(fā)現(xiàn)VC可顯著刺激DC表面CD40表達(dá)，這揭示DC可能通過(guò)VC的氧化-還原調(diào)控能力影響DC細(xì)胞分化、成熟及功能，進(jìn)而影響T細(xì)胞亞群及免疫功能。過(guò)繼免疫治療是目前應(yīng)用程度相當(dāng)廣泛的治療方式，為了快速擴(kuò)增CD3+T細(xì)胞，在培養(yǎng)過(guò)程當(dāng)中一般添加anti-CD3+單克隆抗體，而培養(yǎng)的細(xì)胞主要以CD8+T細(xì)胞為主。本研究發(fā)現(xiàn)，在anti-CD3+單克隆抗體培養(yǎng)體系中，利用VC預(yù)處理DC，之后再與T細(xì)胞混合培養(yǎng)，其CD40L、CD8+CD28+T細(xì)胞亞群會(huì)顯著升高，表明VC-DC可顯著激活活性T細(xì)胞的比例，向非特異性CTL方向分化，并且CD8+T細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2分泌能力也會(huì)有顯著升高，同時(shí)Th2細(xì)胞分泌IL-4能力顯著降低，并且呈現(xiàn)出對(duì)VC的濃度依賴(lài)性。而后續(xù)腫瘤細(xì)胞株殺傷檢測(cè)也證實(shí)上述結(jié)論。

既往研究顯示，VC通過(guò)調(diào)節(jié)DC細(xì)胞功能，可提升CD4+T細(xì)胞分化，而本研究中未有明顯體現(xiàn)（圖2），這很可能是anti-CD3+單克隆抗體的添加，使得T細(xì)胞快速、大量擴(kuò)增，而其中主要以激活CD8+T細(xì)胞增殖為主，因此掩蓋的VC-DC對(duì)CD4+T細(xì)胞的調(diào)控能力，但從流式檢測(cè)細(xì)胞因子情況分析來(lái)看，除CD8+細(xì)胞因子分泌能力顯著提高外，IFN-γ+CD8-T、IL-2+CD8-T細(xì)胞分泌情況也有明顯提高（圖4），而IL-4+CD8-T細(xì)胞變化不明顯，無(wú)顯著意義（P>0.5），這也證實(shí)了VC-DC對(duì)CD4+T體現(xiàn)相同的調(diào)控作用。因此，VC的利用對(duì)于過(guò)繼免疫細(xì)胞治療具有很好的調(diào)節(jié)促進(jìn)作用，可作為細(xì)胞培養(yǎng)中添加的一種類(lèi)激動(dòng)劑。而VC在免疫功能調(diào)控中發(fā)揮的作用以及其對(duì)免疫信號(hào)通路的影響，我們還將做進(jìn)一步研究。

作者：賈原 李文麗 韓亞萍 李芳 張俊萍 單位：山西大醫(yī)院腫瘤生物治療科