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《免疫學雜志》2016年第二期
[摘要]
目的構建、表達和純化相思子毒素B（ATB）鏈蛋白并分析其抗原性和毒性。方法運用密碼子優化軟件優化ATB基因，合成目的基因亞克隆至原核載體pQE-80L構建表達質粒pQE80L-ATB，轉化至E.coliM15獲得表達工程菌株，并對誘導表達條件和純化條件進行優化；通過Westernblot檢測重組蛋白的抗原性；采用人正常肺上皮細胞Beas-2B和胃黏膜細胞GES-1進行重組蛋白的細胞毒性實驗。結果ATB開放閱讀框架全長804bp，編碼268個氨基酸殘基；表達工程菌株在30℃、1mmol/LIPTG，3h后獲得包涵體形式表達的目的蛋白，相對分子質量均約為30000，經Ni-NTA親和層析柱純化后純度達97%以上，Westernblot和MTS實驗結果表明，目的蛋白能特異性識別抗相思子毒素多克隆抗體且無毒性。結論重組ATB蛋白實現高表達，具有良好的抗原性，為相關疫苗研究奠定基礎。
[關鍵詞]
相思子毒素B鏈；抗原性；生物恐怖
相思子毒素（abrintoxin，AT）是來源于相思子（Abrusprecatorius）的一種細胞毒性蛋白，由A鏈（ATA）和B鏈（ATB）2條多肽鏈通過二硫鍵組成，其中A鏈呈酸性，為毒性單位；B鏈呈中性，為結合單位[1-2]，小鼠腹腔LD50約為0.04μg/kg[3-4]。由于AT具有天然資源豐富、制備容易、中毒后無特異癥狀等特點，因此很容易被恐怖分子作為生物恐怖劑使用[4]，也是我國新形勢下反恐工作的重要組成部分。目前，針對毒素中毒免疫預防措施主要包括疫苗主動免疫接種[1,5]和應用抗體進行治療[3,6]2方面，由于中和性抗體只能產生短期的被動免疫保護效果，因此有效的方法是使用預防性疫苗。AT相關生防疫苗的研究較少，包括甲醛化的類毒素[5]和基于A鏈蛋白的疫苗[1]，但二者的使用受限于毒性問題。同時，文獻報道B鏈亞單位同樣具有很好的免疫原性[7-11]，而且其他相關報道顯示作為AT的候選疫苗，B鏈亞單位具有獨特的優勢[12]。首先，如破傷風、霍亂毒素、白喉等其他的A-B家族毒素已經采用其各自的B亞單位制備疫苗并被證明是有效的；其次，由于ATB能特異性的結合到M細胞表面，因此具有佐劑活性；最后，相思子毒素的B鏈是無毒的，因此作為疫苗應用于人體就不存在毒性的問題。本研究旨在利用原核表達系統高效表達重組ATB蛋白；分析重組蛋白的抗原性和細胞毒性，為篩選抗AT中毒的疫苗研制奠定基礎。
1材料與方法
1.1菌株、質粒與細胞pMD18-T載體購自TaKaRa公司；含有目的基因的質粒pUC-ATB由生物公司合成；原核表達載體pQE-80L購自Qiangen公司；宿主菌E.coliDH5α和M15、人正常肺上皮細胞Beas-2B和胃黏膜細胞GES-1為本實驗室保存。
1.2主要試劑2×KODPCR反應試劑（KODDNA聚合酶、PCRBuffer、dNTP混合物）、DL2000核酸Marker、限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ購自大連TaKaRa公司，質粒提取試劑盒為北京天根生物公司產品，5ml鎳預裝柱購自GEhealthcare公司，山羊抗兔IgG購自SantaCruz公司，抗天然AT兔多克隆抗體由本實驗室制備，細胞毒性試驗檢測試劑盒購自Sigma公司，其它化學試劑為國產分析純。
1.3編碼序列的優化與合成天然AT有a、b、c、d4種亞型，a亞型的細胞毒性最強，本研究選取a亞型的氨基酸序列。運用Condonopt軟件，采用GenBank檢索登錄號1908235A優化ATB基因，并在上、下游分別含BamHI、HindⅢ酶切位點，由南京金斯瑞公司合成，獲得pUC-ATB/E.coliTop10F’。
1.4目的基因表達載體的構建BamHI和HindⅢ雙酶切克隆測序載體pUC-ATB和表達載體pQE-80L，膠回收后在16℃、T4DNA連接酶條件下過夜連接，構建重組表達質粒pQE80L-ATB，連接產物轉化至CaCl2法制備的E.coliM15感受態細胞中，構建重組表達菌株M15/pQE80L-ATB，PCR篩選陽性克隆，提取質粒，進行雙酶切鑒定。
1.5重組蛋白的誘導表達和表達形式的確定經PCR和酶切鑒定正確后，挑新鮮單菌落M15/pQE80L-ATB以1∶100轉接于10ml的Amp抗性的LB培養基（100μg/ml）37℃過夜培養。次日按1∶100比例轉接于500ml含Amp抗性的LB液體培養基，于37℃200r/min振搖培養3~4h至OD600nm為0.6~0.8時，加IPTG至終濃度1mmol/L，30℃誘導5h。8000g4℃離心5min收集菌體，沉淀用0.01mol/LPBS洗后重懸，于冰上超聲破碎后，收集上清及沉淀。行凝膠電泳鑒定，并用考馬斯亮藍染色觀察結果。
1.6重組蛋白的純化和定量按1.5方法進行擴大培養，離心收集后將沉淀用0.01mol/LPBS洗滌2次，再分別用2%Tritox-X100、2%Tween-20、1mol/LNaCl、2mol/L尿素各洗滌3次，然后加入BufferA（20mmol/LPB、500mmol/LNaCl、50mmol/L咪唑，8mol/L尿素，pH8.0），并上樣到Ni柱中，經咪唑洗脫后收集蛋白目的峰。將收集的蛋白進行梯度透析復性，分別經4、2、1、0.5mol/L尿素和PBS緩沖液，4℃條件下攪拌48h以上，并用PEG20000濃縮。行SDS-PAGE電泳分析純度，采用BCA法定量。
1.7重組蛋白Westernblot分析行凝膠電泳rATB蛋白和M15/pQE80L空質粒表達的菌體蛋白，并轉移至硝酸纖維素薄膜。將轉好的硝酸纖維素薄膜于3%BSA封閉液中37℃封閉1h，用洗滌液振蕩洗膜3min/次，共3次。抗天然AT兔多克隆抗體（一抗，稀釋度為1∶1000）室溫孵育1h后洗膜3次。再用HRP標記的羊抗兔IgG（二抗，稀釋度為1∶50000）室溫孵育1h，洗膜3次后經化學發光成像系統成像。
1.8重組蛋白毒性分析采用MTS試劑盒測定重組蛋白rATB和天然AT對人正常肺上皮細胞Beas-2B和胃黏膜細胞GES-1的殺傷作用。1640培養基培養人正常肺上皮細胞Beas-2B并計數為（1~2）×104/孔，DMEM培養基胃黏膜細胞GES-1并計數，分別以100μl/孔加入96孔板中。空白孔只加細胞培養基。37℃5%CO2培養箱中生長24h；分別用2種培養基對測定蛋白（分別為rATB或天然AT）進行5倍稀釋后加入100μl/孔（rATB的質量濃度為1000、200、40……0.0001ng/ml；AT的質量濃度為20、4、……0.00001ng/ml），陰性對照孔不加毒素；96孔板至5%CO2細胞培養箱中37℃，培養72h；PBS洗板3遍后96孔板依次先后加入100μl培養基和20μl試劑盒自帶的MTS，并在37℃條件下培養2h；MultiskanMk3酶標儀上讀取A490nm值并計算細胞生存率。
2結果
2.1重組質粒pQE80L-ATB的構建和鑒定優化ATB基因序列成大腸桿菌高頻密碼子，ATB全長786bp，編碼268個氨基酸殘基。用BamHI/HindⅢ對重組質粒pQE80L-ATB進行酶切鑒定和PCR鑒定。圖1結果顯示成功構建了重組質粒pQE80L-ATB。
2.2重組蛋白的誘導表達M5/pQE80L-ATB工程菌在沉淀中出現大量目的蛋白，相對分子質量約為30000（圖2a），表達量約占73.43%。經Ni柱純化，目的蛋白在含500mmol/L咪唑洗脫液中被洗脫下來（圖2b），純化后的純度為97%左右。經復性、濃縮后質量濃度約為0.832mg/ml。
2.3重組蛋白的抗原性分析免疫印跡顯示，純化后的rATB蛋白能特異性的與抗天然AT兔多抗體發生反應（圖3），說明目的蛋白具有特異的抗原性。
2.4重組蛋白的毒性分析MTS法測定rATB對細胞毒性實驗表明，rATB對人正常肺上皮細胞Beas-2B和胃黏膜細胞GES-1是無毒性的，這與文獻報道相一致；同時細胞存活曲線圖4表明天然AT對Beas-2B的IC50約為0.16ng/ml，圖5顯示GES-1的IC50約為0.032ng/ml。
3討論
AT是植物來源的蛋白毒素，屬于Ⅱ型核糖體失活蛋白（RIP），其毒性是普通化學武器的幾百倍，是迄今為止所發現的毒性最強的植物毒素之一[1]，發展有效的防治手段已成為各國生防領域的重要研究任務，而主動免疫是一種預防毒素中毒的有效方法。目前關于AT相關的生防疫苗研制較少。其中，類毒素是將天然毒素經甲醛化處理后可以保護免疫動物的致死劑量毒素中毒[5]，由于具有一定毒性而未有進一步的發展。2008年，Surendranath等[3]報道了一種中和性IgG單抗（D6F10），可以在細胞內或小鼠體內抑制AT中毒。2011年，我室Han等[1]采用定點突變技術獲得ATA突變體（mABRAE164AR167L），能抵抗10×LD50劑量的天然毒素攻毒，顯示出良好的免疫原性。
關于毒素B鏈的免疫原性則存在爭議，有文獻報道B鏈的免疫原性不如A鏈[8-10,13-16]，不適合做疫苗候選。但也有研究者認為證明B鏈亞單位同樣具有很好的免疫原性，而且其他毒素的B鏈蛋白已被證明是一種良好的疫苗候選抗原[12]。此外，B鏈蛋白在毒素中發揮結合鏈作用，因此在缺乏A鏈的情況下，B鏈蛋白是無毒性的，這也是B鏈蛋白疫苗優于基于A鏈蛋白或全毒素疫苗的優勢。本研究首先應用密碼子優化軟件Condonopt對ATB進行基因優化，替換大腸桿菌稀有密碼子為高頻密碼子，并成功構建原核表達載體pQE80L-ATB，重組蛋白以包涵體形式存在，且相對分子質量均約為30000，采用Ni-NTA親和層析柱純化，蛋白純度均達97%以上。經免疫印跡實驗驗證，rATB可與相應的抗天然AT兔多克隆抗體發生特異性反應，MTS細胞毒性試驗結果表明rATB無毒性，這與文獻報道相一致[11]。總之，本研究在大腸桿菌表達系統中獲得rATB的高效表達，重組蛋白無毒性且保留了良好的抗原性，為下一步研究相思子B鏈疫苗奠定了基礎。
作者：王俊虹 楊帆 魏茂提 單位：天津市職業與環境危害防制重點實驗室 武警后勤學院救援醫學系部隊衛生統計和流行病學教研室