高效液相色譜法檢測環氧蟲啶范文

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《農藥學學報》2016年第二期

摘要：

建立了環氧蟲啶在柑橘和土壤中殘留量測定的高效液相色譜(HPLC-UVD)分析方法。柑橘樣品采用V(蒸餾水)∶V(二氯甲烷)=1∶2提取后經弗羅里硅土柱凈化(土壤樣品提取后直接測定)，HPLC-UVD測定，外標法定量，并運用此方法對田間樣品進行了環氧蟲啶殘留量檢測驗證。結果表明：在0.05~5mg/L范圍內，環氧蟲啶質量濃度與對應的峰面積間呈良好線性關系，線性方程為y=10243x+233.0(R2=0.9990)；土壤和柑橘中環氧蟲啶的最低檢測濃度均為0.1mg/kg；在0.1~1mg/kg3個添加水平下，環氧蟲啶在土壤和柑橘中的平均回收率在76%~93%之間，相對標準偏差(RSD,n=5)在1.6%~5.8%之間。該方法快速、靈敏、穩定，可用于柑橘和土壤中環氧蟲啶殘留量的檢測。

關鍵詞:

高效液相色譜；環氧蟲啶；柑橘；土壤；殘留

環氧蟲啶(cycloxaprid)，化學名稱為9-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-4-硝基-8-氧雜-10,11-二氫咪唑并[2,3-a]雙環[3,2,1]辛-3-烯)，化學結構式見圖式1，是中國華東理工大學和上海生農生化制品有限公司聯合開發的一類順硝烯氧橋雜環新煙堿類殺蟲劑，主要用于半翅目害蟲如稻飛虱、蚜蟲、煙粉虱等的防治[1]，其作用機理與之前的新煙堿類殺蟲劑有著本質的區別，是國際上首個nAChR抗結劑[2-3]。Shao等[4]的研究表明，環氧蟲啶和蚍蟲啉對蚜蟲的LC50值分別為0.00471和0.3502mmol/L，對粘蟲的LC50值分別為0.03873和0.12549mmol/L，環氧蟲啶活性顯著優于吡蟲啉。環氧蟲啶對哺乳動物的急性毒性屬低毒，低于傳統的新煙堿類殺蟲劑，對非靶標生物如水蚤類、魚類、土壤微生物和其他植物的影響甚微，對蜜蜂的毒性與吡蟲啉相比也顯著降低[5-6]，極有可能成為國際上具有重要影響力的新一類殺蟲劑。目前，對環氧蟲啶的研究主要集中在生物活性[7-10]、作用方式[11-12]和環境行為[13-18]等方面。根據國際上農藥殘留物定義，環氧蟲啶在柑橘中的殘留是必檢項目[19]，而有關環氧蟲啶在環境基質中殘留量的分析方法研究甚少[20-21]。目前未見文獻報道環氧蟲啶在柑橘土壤、橘皮、橘肉、全果中殘留的檢測方法，國際上也未制定食品中環氧蟲啶的MRL值[22-23]。故筆者以水-二氯甲烷為提取劑，柑橘樣品超聲提取后經弗羅里硅土柱凈化(土壤樣品提取液直接測定)，建立了環氧蟲啶殘留的HPLC-UVD檢測方法，并應用該方法對25%環氧蟲啶可濕性粉劑在田間柑橘和土壤樣品中的殘留量進行了檢測，以期為環氧蟲啶在環境中的殘留監測提供科學依據。

1材料與方法

1.1儀器與藥劑LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司，帶紫外檢測器和LCsolution化學工作站)；RE-2000旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；DLSB-5L/25低溫冷卻液循環泵、玻璃儀器氣流烘干器及SHZ-D(III)循環水式真空泵(河南省鞏義市英峪予華儀器廠)；JYL-B062九陽料理機(九陽股份有限公司)；TD5A臺式高速離心機(長沙英泰離心機儀器有限公司)；BOMEX層析柱(1.5cm×20cm，天津市天波玻璃儀器有限公司)。99.5%環氧蟲啶(cycloxaprid)標準品(農業部農藥檢定所)；25%環氧蟲啶可濕性粉劑(上海生農生化制品有限公司)，乙腈(色譜純)；娃哈哈飲用純凈水；無水硫酸鈉、二氯甲烷和乙腈(分析純)；60~100目弗羅里硅土(150~250μm，650℃下烘烤3h，加5%蒸餾水脫活后使用)。

1.2檢測條件InertsilODS-SP色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相為V(乙腈):V(水)=60:40；流速0.6mL/min；檢測波長348nm；柱溫40℃；進樣量20μL。

1.3樣品的提取與凈化

1.3.1提取土壤樣品去掉砂石和植物殘體，研碎過20目篩(粒徑850nm)，四分法縮分留樣250g。柑橘全果、橘肉和橘皮分別切碎、勻漿，四分法縮分，留樣250g。分別準確稱取土壤、柑橘全果、橘肉和橘皮樣品各10g(精確至±0.1g)于250mL具塞三角瓶中，分別加入10mL蒸餾水和20mL二氯甲烷，靜置20min后超聲提取20min；將柑橘樣品提取液轉移至離心管中，于3600r/min下離心5min，取有機相10mL，于45℃下旋蒸濃縮至近干，待凈化。土壤樣品提取液用色譜純乙腈定容到2mL，過0.45μm有機濾膜，按1.2節條件測定。

1.3.2凈化參照文獻[24-25]并加以改進：分別將2mL分析純乙腈加入柑橘全果、橘肉和橘皮提取液并轉移至已制備好的弗羅里硅土層析柱(從下至上依次裝填有少許脫脂棉、2g無水硫酸鈉、5g弗羅里硅土、2g無水硫酸鈉)中；先用10mL分析純乙腈預淋洗，棄去淋洗液，再用40mL分析純乙腈少量多次洗脫，收集全部洗脫液，于45℃下旋蒸濃縮至近干，用色譜純乙腈定容到2mL，過0.45μm有機濾膜，按1.2節的條件測定。

1.4標準溶液的配制及標準曲線繪制準確稱取環氧蟲啶標準品0.025g(精確至±0.0001g)，用色譜純乙腈溶解并定容至50mL，配制成500mg/L的標準品母液，于4℃貯存，備用。試驗時再用色譜純乙腈梯度稀釋，配成質量濃度分別為0.05、0.5、1、2和5mg/L的標準工作溶液，按1.2節條件測定。采用外標法定量。以進樣質量濃度為橫坐標、相應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.5添加回收試驗在0.1、0.5和1mg/kg3個添加水平下，每個水平重復5次，按1.3節方法進行樣品前處理，按1.2節條件測定。

1.6田間試驗試驗于中國湖南長沙市進行。分別設推薦使用劑量和高劑量兩種施藥量，即按25%環氧蟲啶可濕性粉劑對水稀釋2000倍液(有效成分為125mg/kg)和1333倍液(有效成分為187.5mg/kg)，選擇從未施用過環氧蟲啶的地塊中樹齡為5a左右、長勢良好的柑橘樹進行試驗。對每小區柑橘樹噴霧施藥2~3次，以柑橘葉和果實有藥液開始滴落為度，施藥間隔期為10d，每處理重復3次。分別距最后一次施藥10、20和30d于每小區隨機選取10個點以上，采集0~15cm的土壤樣品約2kg，以及隨機按上、下、內、外、向陽和背蔭方向采集柑橘樣品2kg，于–20℃貯存，備用。

2結果與討論

2.1方法的線性范圍及檢出限結果表明：在0.05~5mg/L范圍內，線性方程為y=10243x+233.0(R2=0.9990)，表明環氧蟲啶質量濃度與對應的峰面積間呈良好的線性關系。環氧蟲啶在柑橘全果、橘肉、橘皮和土壤樣品中的最低檢測濃度均為0.1mg/kg。

2.2方法的準確度與精密度結果(表1和圖1)表明：在0.1、0.5和1mg/kg3個添加水平下，環氧蟲啶在土壤及柑橘中的平均回收率在76%~93%之間，相對標準偏差在1.6%~5.8%之間，均符合農藥殘留分析方法的技術要求[26]。

2.3色譜條件的優化由于環氧蟲啶標準溶液在348nm處有最大吸收峰，故選擇348nm作為檢測波長。分別以乙腈-水、甲醇-水不同比例作為流動相，綜合考慮環氧蟲啶的保留時間及峰形，最終確立以V(乙腈):V(水)=60:40為流動相，流速為0.6mL/min，柱溫40℃。環氧蟲啶標準溶液色譜圖見圖2。在此檢測條件下，以3倍信噪比計，儀器對環氧蟲啶的最小檢出量為1ng。由圖2可看出該方法對環氧蟲啶具有較好的分離效果。

2.4提取劑選擇和提取條件的優化根據環氧蟲啶的極性與溶解性，分別考察了以二氯甲烷、丙酮、乙腈、二氯甲烷-水、二氯甲烷-氯化鈣為提取劑，同時分別采取超聲、水浴振蕩和恒溫振蕩等提取方式對比提取效果。結果表明：采用各單一提取劑均不能滿足農藥殘留檢測技術要求，其中二氯甲烷、丙酮和乙腈提取率分別為45.3%、47.8%和48.4%。考慮到乙腈對實驗者的危害和成本較高等問題，丙酮提取色素較多對目標化合物的峰形干擾較大，故選擇二氯甲烷作為土壤樣品的提取劑，且添加10mL的蒸餾水后[21]，其回收率接近90%，故最終選取V(蒸餾水):V(二氯甲烷)=1:2為提取劑(表2)。此外，采用振蕩提取方式提取土壤樣品時，提取效果不理想，而采用超聲波提取卻獲得了較好的提取效果，故選擇超聲波提取。柑橘樣品采用了與土壤樣品相同的前處理方式，但因柑橘樣品中的共提雜質較多，干擾目標化合物的峰形，因此需進一步凈化。

2.5凈化方法的優化

2.5.1層析柱的選擇結果表明：采用中性氧化鋁層析柱凈化柑橘樣品時，雜質與目標化合物均被吸附，未檢測到目標峰；而用弗羅里硅土柱凈化時，雜質與環氧蟲啶分離效果好且回收率達100.2%，達到農藥殘留檢測與分析的要求[26]。

2.5.2洗脫液體積的確定由圖3淋洗曲線可知：大部分環氧蟲啶集中在前40mL淋洗液中，回收率達到99%以上，從收集的第5個10mL淋洗液中僅檢測出極少量的環氧蟲啶，第6個10mL淋洗液中未檢出環氧蟲啶，綜合考慮，最終確定采用40mL洗脫。

2.6方法的應用筆者采用本研究建立的分析方法，于2014年在中國湖南長沙進行了環氧蟲啶殘留的田間試驗。對采集于不同環氧蟲啶施藥劑量、不同施藥次數下柑橘果園里的柑橘和土壤樣品進行了環氧蟲啶殘留量檢測，結果(表3)表明該方法符合農藥殘留檢測的要求[26]。

3結論

本研究建立了柑橘及土壤中環氧蟲啶殘留量的高效液相色譜檢測方法，樣品采用蒸餾水-二氯甲烷超聲提取；柑橘樣品經弗羅里硅土層析柱凈化，HPLC-UVD測定；土壤樣品提取后無需凈化直接測定。該方法準確性好、精密度高，與陳敏[20]的土壤提取方法相比，具有操作簡便、省時、成本較低等優點。本研究結果可為環氧蟲啶在柑橘作物上的安全性評價及在其他農作物中的殘留檢測方法研究提供參考。

作者：聶紅英 楊仁斌 趙運林 吳育佳 歐陽文森 單位：湖南農業大學 農業環境保護研究所 湖南農業大學 生物科學技術學院 杭州師范大學 生命環境與科學學院