酵母在工業生物技術中的應用范文

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《中國生物工程雜志雜志》2014年第七期

1K．marxianus生產酶類

K．marxianus在產酶方面的應用是其在現代工業生物技術應用過程中的最重要的組成部分之一。實驗結果表明，K．marxianus可以分泌產生十余種工業生物技術領域的水解酶(表1)。K．marxianus在生產酶類方面具有的優勢，除去本身的耐高溫、生長快等特點，還可以利用較為廉價的底物或者誘導物，如乳清和玉米漿［4］等發酵生產酶類，是工業生產過程中獲得更為廉價、更多種類酶類的重要保證。同時，一些熱穩定酶類如脂肪酶、葡萄糖苷酶等均可以從K．marxianus的培養過程中獲得。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)或者乳糖酶可以水解奶制品中的乳糖供許多乳糖不耐癥患者食用，可以解決乳清的處理問題，而且還能生成一種功能性食品 添加劑———低聚半乳糖，促進人體內雙歧桿菌等益生菌增殖，在食品和醫藥工業中具有重要應用。目前的商業用半乳糖酶一般來自于乳酸克魯維等菌株，但其分泌效率太低。K．marxianus是近年來備受關注的產酶菌株，其產生的半乳糖苷酶是一種誘導酶，在葡萄糖培養基中表達量不高，在含有乳糖的培養基中能夠得到較高產量的半乳糖苷酶。但也有研究表明一些其他的廉價底物也可以作為誘導物用于K．marxianus半乳糖苷酶的生產，如玉米漿。以100g/L的玉米漿為底物，K．marxianus所產半乳糖苷酶比用乳糖為培養基時高20%。此外，溶氧對半乳糖苷酶的生產至關重要，當攪拌轉速/通氣速率為700r/min/0．66vvm時，半乳糖苷酶的產量比在500r/min/2vvm時高50%。采用γ-射線對K．marxianus進行誘變后，提高了β-半乳糖苷酶的產量及對熱的耐受性，敲除轉錄抑制因子Mig1的突變株K．marxianusKM實現了β-半乳糖苷酶的過表達，達到121．0U/ml。同時，由于半乳糖苷酶是胞內酶，為了提高其水解乳糖的效果，純酶的使用更能滿足產業化需求。因此，研究半乳糖苷酶分離純化方法，是滿足其工業化使用的必要前提。

菊粉酶是一類能夠水解β-2，1果糖糖苷鍵的水解酶，按其作用方式，可分為內切型菊粉酶(o-inulinase)和外切型菊粉酶(ex-inulinase)。目前，菊粉酶廣泛應用于低聚果糖和高果糖漿生產、以及菊芋乙醇生產等多個領域。但到目前為止，國內外學者關于菊粉酶的研究大多注重產酶菌株的篩選、發酵條件優化及酶基因克隆等方面，涉及菊粉酶分泌表達調控的報道極少。菊粉酶的表達調控機制十分復雜，而且表現為明顯的菌種依賴特性。目前還沒有完整的調控體系了解其合成過程，嚴重阻礙了菊粉酶在工業化中的應用。菊粉酶的分泌除受底物誘導、分解物阻遏外，還與發酵體系中的溶氧和氮源等因素密切相關。克魯維酵母菊粉酶的表達受到分解產物的阻遏，該阻遏是發生在轉錄水平，但對于其中的調控機制仍不清楚。碳源代謝抑制因子CreA和糖代謝激活因子InuR在菊粉酶表達調控中具有重要作用。Silva-Santisteban等發現在葡萄糖、果糖和蔗糖中，菊粉酶分泌的細胞外動力學相似，但是蔗糖濃度對菊粉酶活力影響很大，而且富含O2的空氣，既不能提高菊粉酶的產量也不能抑制乙醇的生產。菊粉酶的活性是采用集成生物加工策略(CBP)發酵菊芋生產乙醇的最關鍵因素。因此，研究和了解菊粉酶的相關調控機制，對于菊粉基原料的CBP技術的發展至關重要。我們實驗室研究了K．marxianusYX01菊粉酶的表達調控的相關影響因素，結果表明菊粉對菊粉酶的產生具有一定的誘導作用，而葡萄糖對產酶過程有一定程度的抑制作用;碳源濃度對K．marxinausYX01產酶具有較為顯著的抑制作用，當菊粉濃度為60g/L時，菊粉酶的活性僅有20g/L時的50%。通氣量對菊粉酶分泌有較大影響，當通氣量超過0．5vvm時，菊粉酶活力可達到不通氣時的4倍。外加高濃度乙醇對細胞生長有明顯的抑制作用，但并沒有影響菊粉酶分泌，而且對于分泌到胞外的菊粉酶，其活性基本不受外加乙醇的影響。菊粉酶的產生與乙醇發酵條件是矛盾的兩個方面，闡明乙醇發酵條件下菊粉酶分泌及相關代謝調控機制，是提高菊粉酶活性進而提高生產效率的關鍵。

多聚半乳糖醛酸酶(ploygalacturonase，PG)能夠隨機地水解兩個非甲基化的半乳糖醛酸間的α-1，4-糖苷鍵，在水果和蔬菜加工領域具有重要應用。PG除在高等植物、霉菌和細菌中存在，也存在于蝸牛的消化液中。但商業化應用的半乳糖醛酸酶除含PG活性外，還存在不需要的甲酯酶(PE)和淀粉酶。K．marxianus能夠分泌PG而無PE活性，是生產多聚半乳糖醛酸酶的理想菌株。目前影響K．marxianusPG合成因素的研究主要集中在碳源和溶氧兩個方面。溶氧是PG合成過程中的限制因素，無氧條件有利于PG的積累，而隨著溶氧濃度的增加，PG合成明顯受到抑制，甚至停止分泌。同時碳源對于PG的合成也具有不同程度的影響。研究結果表明，果膠的添加有助于PG的合成分泌，而半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸或乳糖抑制了PG的合成，甚至使其無法表達。因此，合適的微氧環境(同時滿足單細胞生長及PG生產的必須)及碳源誘導物的添加將是K．marxianusPG合成研究的重要方向。脂肪酶廣泛應用于有機化學合成、醫藥、食品、皮革、生物轉化等多個領域。K．marxianus分泌的脂肪酶由于具有明顯的熱穩定性而受到廣泛關注。而且以K．marxianus作為宿主異源表達酯酶(或脂肪酶)為酯酶的研究提供了新的方向。K．marxianus能夠分泌β-葡萄糖苷酶、木糖酶等纖維素水解所需的酶類，在纖維素降解過程中起重要作用。過氧化物歧化酶(SOD)［34-35］、氨肽酶等也均見于K．marxianus分泌產物中，它們也都是因其較高的熱穩定性而被人們所關注。但是對于這些低產量酶來說，濃縮以及分離純化技術的研究顯得尤為重要。110綜上所述，K．marxianus所產不同種類的水解酶在生產過程中具有不同的優勢與缺點，但就總體而言仍停留在實驗室階段，并未真正實現工業化，主要的問題就是如何盡可能提高其產酶水平來達到工業化的要求。據文獻報道，克魯維酵母與釀酒酵母不同，屬于Crabtree-negative，因此其生長發酵的調控機制存在差異。最基礎的方式可以采用培養條件的優化在一定程度上提高酶活力;進一步研究產酶過程對于氧氣傳遞的響應，全面理解氧氣在產酶過程中的重要作用;最后可以采取突變育種或者基因工程改造的方式，獲得較為高產的菌株。另外，對于酶的分離純化工藝的研究，也將是推進其工業化進程的重要方面。

2K．marxianus乙醇發酵

生物乙醇是目前為止研究最早、技術最為成熟的生物質能源產品，是公認的最有可能替代化石能源的生物質能源之一。而K．marxianus因其較為廣泛的碳源譜，是現今利用廉價原料生產乙醇的理想菌株。K．marxianus能夠在較高溫度的條件下發酵乙醇，為工業生產過程大大節約了成本，并減小了污染的可能性。表2給出了K．marxianus利用菊芋、糖蜜、乳清、纖維素等不同底物產乙醇的情況。菊芋(Jerusalemartichoke，JA)以其耐瘠薄、耐鹽堿、抗干旱和生物質產量高等優點被國家列為重點發展的非糧能源植物，其塊莖中的主要成分是菊粉，占干重的60%～70%，由果糖殘基經β-2，1糖苷鍵脫水聚合而成，末端為一個葡萄糖分子，可以通過酸解和酶解等途徑轉化為易于發酵的果糖。以菊芋作為燃料乙醇的底物已進行了廣泛的研究，其中利用同時具有產菊粉酶和乙醇發酵能力的克魯維酵母進行乙醇發酵(CBP技術)是最有希望實現工業化生產的技術路線，但仍然存在發酵時間長、終點乙醇濃度低及剩余殘糖高等缺點。最近，有學者報道了綜合利用菊芋秸稈和塊莖，進行全生物質的發酵過程，也為菊芋乙醇的工業化提供了更為全面的保證。我們實驗室對于利用菊芋生產乙醇進行了大量的工作。篩選得到的K．marxianusYX01，以菊粉為底物，發酵終點乙醇濃度92．2g/L，達到理論值的85．5%;同時開發了批式補料工藝，菊芋干粉生料發酵的終點乙醇濃度達到94．2g/L。通過添加輔助酶制劑及換用不同的攪拌槳，進一步降低發酵過程中醪液黏度大的問題，使乙醇的終濃度及收率得到提升，為其工業化生產奠定了基礎。但是，我們實驗發現在相對無氧條件下乙醇得率高于有氧條件，而發酵時間卻大大延長，這嚴重制約了菊芋乙醇的工業化進程。因此，今后的工作將從提高限氧發酵過程中菊粉酶活力或調控發酵過程的通氣量來達到在較短發酵時間下實現更高的乙醇得率。K．marxianus可以直接利用乳清中的乳糖生產乙醇。乳清是干酪和干酪素生產過程中的一種副產品，主要成分為乳糖(74%)，其次還有一些蛋白質、礦物質和脂肪等，是一種理想的生產乙醇的廉價原料。發酵乳清生產乙醇還可以解決乳制品生產中廢水排放的問題。但是，一般來說乳清中的乳糖含量較低，使得發酵終點的乙醇濃度較低，增加了后續蒸餾成本。但是，通過培養條件的不斷優化，利用乳清中的乳糖直接生產乙醇的規模化生產也將越來越具有競爭力。

對于K．marxianus發酵糖蜜生產乙醇的報道也比較廣泛。糖蜜是制糖工業的一種副產品，也是一種較為理想的廉價材料。糖蜜種類較多，包括甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、葡萄糖蜜等，不同種類的糖蜜糖含量、糖種類具有差異。以甘蔗糖蜜為例，其還原糖總量可以達到50%～60%(w/v)，其中蔗糖占60%左右。此外，糖蜜中還含有一些氮源、生物素等促進細胞生長的物質，但同時也含有一些對細胞有毒害作用的物質。在使用糖蜜為碳源時，由于糖濃度較高，要求細胞耐滲透壓的能力好，對乙醇的耐性也要求較高。利用秸稈等纖維素原料生產乙醇一直都是人們關注的重點，廉價的原材料可以更大程度地降低燃料乙醇的生產成本，使其在燃料市場上具有更強的競爭力。秸稈中主要含有40%左右的纖維素，還含有半纖維素、木質素和灰分等組分，水解后得到的葡萄糖、木糖等可以被微生物利用生產乙醇。同步糖化發酵工藝(SSF)由于能降低分解產物對纖維素酶的抑制作用，是纖維素乙醇生產最有前途的工藝路線。從目前的研究來看，纖維素酶的最適溫度為50℃左右，與大多數微生物生長的最適溫度30℃或者37℃不一致，使得SSF發酵過程效率很低。K．marxianus具有在高溫條件下生長并產生乙醇的特性，所以利用K．marxianus實現纖維素乙醇的同步糖解共發酵，是未來纖維素乙醇的重要研究方向。來源于Aspergillusniger的內切β-1，4葡聚糖酶(o-β-1，4-glucanase，EG)基因和來源于Thermoascusaurantiacus的β-葡糖苷酶(β-glucosidase，BGL)基因、纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH)基因已成功地整合于K．marxianusNBRC1777基因組，在45～50℃條件下，實現了纖維素酶的功能表達，為今后更好地實現同步糖化發酵纖維素類原料生產乙醇奠定了基礎;此外，纖維素降解后含有35%左右的五碳糖，很難被常規的乙醇發酵微生物如釀酒酵母所利用。K．marxianus可以利用木糖等生產乙醇，在五碳糖的利用方面具有較為明顯的優勢。但是，K．marxianus利用木糖的速率方面及乙醇的產率還需要進一步提高。以K．marxianus為宿主，利用表面展示的方法，將纖維素降解所需的各種酶類如EG、BGL、CBH及木聚糖利用的酶類如木糖苷酶、木糖轉運酶等表達，構建聯合加工菌株(CBP菌株)，可能是未來解決纖維素乙醇生產的途徑。

3K．marxianus作為宿主表達外源蛋白

酵母細胞用于外源蛋白的分泌表達一直受到人們的廣泛關注，S．cerevisiae、P．pastoris等研究相對成熟的表達系統以其適于大規模生產、翻譯后修飾系統較為完善以及無內毒素污染等優點而被研究人員廣泛應用。但同樣酵母細胞也具有信號肽加工不完全、誘導周期長等缺點。近年來，K．marxianus作為宿主細胞用于表達外源蛋白方面的應用越來越多。三種表達系統的優勢和不足見表3。正是由于K．marxianus在表達外源蛋白方面所特有的優勢，對其進一步的研究以及開發利用顯得更為重要，而且隨著研究和應用的深入，K．marxianus作為宿主表達外源蛋白將能更好地彌補另兩種酵母的不足，取長補短，更加深化酵母宿主表達外源蛋白的應用。

3．1K．marxianus表達載體、啟動子以及轉化方法的研究進展表達載體是基因外源表達的關鍵。最早應用于K．marxianus轉化的表達載體，pGL2，出現在1984年。但是，真正使得K．marxianus作為表達宿主而受到人們關注是由于pKD1質粒的發現，pKD1質粒全長4．8kb，目前以其為基礎而獲得的多種雜交質粒已廣泛應用于外源蛋白表達的研究中。啟動子的選擇決定了外源基因表達的成敗。目前應用于K．marxianus表達系統的啟動子分為三類:(1)其自身啟動子，如PCLP，INU1［68-69］等，而且有實驗表明，比起S．cerevisiae啟動子，K．marxianus自身啟動子會明顯提高異源基因在其中的表達量。Bergkamp等使用INU1成功地實現了β-半乳糖苷酶的異源表達;(2)來源于S．cerevisiae啟動子，如TDH3，GAL1等。目前針對它們的研究也較為廣泛，許多S．cerevisiae中較為成熟、功能明確的啟動子均可直接用于K．marxianus外源基因表達。Nonklang等以ScTDH3為啟動子使得曲霉α-淀粉酶基因得到表達;Lee等測試了四種在S．cerevisiae較為常見的啟動子應用于K．marxianus異源表達的情況，4種啟動子表達強弱為PGPD＞PADH～PTEF＞＞PCYC，為今后異源基因在K．marxianus不同程度的表達奠定了基礎;(3)非酵母啟動子，如利用Tet-off［70］啟動子構建的pTetGus載體成功地實現了β-葡萄糖醛酸酶基因的異源表達。適當的轉化方法也在整個重組過程中發揮重要作用。一套由LiAc介導的K．marxianus細胞轉化方法可以簡單、快捷地用于K．marxianus的轉化過程。而且DMSO對于轉化過程具有抑制作用，而DTT具有促進作用，10mmol/L的DTT最適于轉化過程的進行。多基因同時整合入K．marxianus染色體技術［73］的實現不但大大節省了人力與時間，也說明了K．marxianus作為宿主正在研究中逐步趨于成熟。

3．2典型外源蛋白在K．marxianus表達系統中的分泌表達K．marxianus作為宿主表達異源蛋白具有更高的分泌效率，這為后續的分離純化以及工業化生產降低成本奠定了基礎。研究表明，K．marxianus所表達的一種熱穩定酯酶，50%左右分泌到了胞外，而相應的在K．lactis和S．cerevisiae中只有12%左右，而且在K．marxianus中，只有17%的酶存在于周質空間，但在K．lactis中達到了25%，在S．cerevisiae中，甚至超過了80%。負責酵母菌絮凝性狀的絮凝基因成功地在K．marxianus中得到表達［71］，使其具有絮凝性狀，可能會提高其對纖維素預處理過程中生成的有毒物質的耐性及乙醇耐性，為今后其在纖維素乙醇發酵中的應用提供了保證。對于K．marxianus外源基因的表達研究在很大程度上受制于其基因工程操作方面理論的不足，很多在S．cerevisiae和K．lactis中比較成熟的轉化系統、啟動子等都很難用于K．marxianus的表達過程，而且成功表達的基因在其蛋白產量、酶活力或者優良性狀的獲得方面還有待于進一步改善，蛋白或者酶的進一步分離提純方法以及產量的進一步提高也有待于更多的研究。

4展望

綜上所述，K．marxianus在產酶、乙醇發酵、外源蛋白分泌等方面都具有較為廣泛的應用。K．marxianus所分泌的水解酶用途廣泛，在食品、醫藥、生物材料、發酵等諸多領域均有較大的市場需求。而其利用菊芋、乳清、糖蜜、纖維素等生產乙醇也十分符合目前生物能源的發展趨勢，為降低成本、增加生物乙醇工業化可行性打下基礎。K．marxianus在外源蛋白表達以及基因工程改造上的進展拓寬了其在工業生物技術方面的應用前景，這使K．marxianus在整個生物技術領域實現了全面的、完整的應用體系。但要實現K．marxianus在工業生物技術領域的廣泛應用，尚需要更多的理論支持。首先，在產酶方面，K．marxianus分泌的酶類普遍表現出受分解產物的抑制作用，所以各酶類的分泌表達機理有待于進一步研究，闡明機理、消除抑制作用最終實現可控表達;其次，在乙醇發酵方面，由于其乙醇耐受性較釀酒酵母差，所以，提高K．marxianus的乙醇耐受性將是該菌株能在生物乙醇產業中應用的前提;再次，在外源蛋白表達和基因工程改造方面，目前對于K．marxianus外源基因的表達研究在很大程度上受制于其基因工程操作方面理論的不足，需要構建更加完善的表達系統和啟動子。雖然K．marxianus全基因組序列粗框架已公布，但其基因組的注釋及代謝網絡的確定將為其在基因工程方面的應用提供更加有效的理論支持。

作者：高教琪韓錫銅孔亮袁文杰王娜白鳳武單位：大連理工大學生命科學與技術學院