Taq基因在畢赤酵母中的表達范文

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《生物工程學報雜志》2014年第六期

1材料與方法

1.1菌種和質粒大腸桿菌XL10-Gold購于Stratagen公司。畢赤酵母GS115購于Invitrogen公司。畢赤酵母表達載體pHBM905A由本實驗室構建[9]。

1.2主要試劑限制性內切酶NotⅠ、CpoⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ，SolutionⅠ連接套裝及DNA分子量標準均購于TaKaRa公司；質粒抽提和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于Axygen公司；蛋白分子量標準購于Fermentas公司；dNTPsMix購自捷瑞公司；Pfu高保真聚合酶購自東洋紡公司；所用PAGE純引物在上海桑尼生物工程公司合成；二肽N-芐氧羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸(Z-Phe-Leu)為武漢Bioyears公司合成；其他常規試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.3Cpasetaq基因體外合成及表達載體pHBM905A-CpaseTaq的構建通過NCBI查詢到該基因對應的氨基酸序列(GenBankAccessionNo.P42663.2)，其下游額外添加6×His標簽，總共517個氨基酸，利用DNAWorks3.2[10]依據密碼子優化設計需要的引物(未列出)，采用兩步合成全基因的方法[11]合成上述基因。載體pHBM905A以NotⅠ、CpoⅠ雙酶切，目的基因經T4DNA聚合酶處理后與載體連接[9]，陽性克隆由上海桑尼生物工程公司測序并進行序列分析。

1.4質粒pHBM905A-CpaseTaq轉化畢赤酵母GS115測序正確的重組質粒和空載體pHBM905A分別經SalⅠ線性化，溶液回收后各得10μgDNA。將線性化的質粒分別電轉化至畢赤酵母GS115感受態細胞，涂布MD平板，培養60h后利用菌落PCR鑒定陽性克隆，實驗以轉化空載體pHBM905A的酵母菌作為負對照。

1.5畢赤酵母重組子誘導表達誘導表達方法參照Invitrogen畢赤酵母操作手冊。

1.6SDS-PAGE分析SDS-PAGE分析方法分別參照Bio-Rad實驗手冊。

1.7羧肽酶Taq純化將誘導72h后的培養基5000r/min離心10min，粗酶液經截留分子量為30kDa超濾膜超濾處理，并用50mmol/LTris-HCl(100μmol/LZn2+，pH7.2)洗滌粗酶液，繼續超濾以除掉粗酶液中的培養基。親和層析柱用50mmol/LPBS(10mmol/L咪唑，pH7.2)洗滌10個柱體積，緩慢加入超濾后的酶液。酶液和層析柱在4℃孵育90min，棄去未結合上清，層析柱用50mmol/LPBS(20mmol/L咪唑，pH7.2)洗滌20個柱體積。目的蛋白以50mmol/LPBS(50、100、150、200、250、300、350、400mmol/L咪唑，pH7.2)分別洗脫。

1.8去糖基化處理羧肽酶的脫糖基化實驗參照NEB公司操作說明。1.9羧肽酶Taq酶活力測定及酶活力單位定義酶活測定參照Doi等的方法[12]，酶活測定以Z-Phe-Leu為底物，用50mmol/LTris-HCl(pH7.5)，70℃反應15min，茚三酮作為顯色劑，測定復合物在505nm處的光吸收值。配制不同濃度的亮氨酸標準溶液，繪制亮氨酸標準曲線。酶活單位定義：每1min水解生成1μmol亮氨酸所需的酶量作為一個酶活力單位(U)。

2結果

2.1表達載體pHBM905A-CpaseTaq的構建表達載體pHBM905A經NotⅠ、CpoⅠ雙酶切，通過兩步法合成基因，將回收的基因片段(圖1A)連接到載體pHBM905A上，并轉化至大腸桿菌XL10-Gold，轉化子以基因專一性引物進行菌落PCR初篩，初篩質粒再經EcoRI、BamHI酶切，瓊脂糖凝膠電泳顯示出酶切后釋放出大小3000bp左右的DN段帶，與預期大小(3050bp)相符合，上述重組子(圖1B)經上海桑尼生物工程公司測序，測序結果完全正確。

2.2畢赤酵母重組子鑒定及羧肽酶Taq誘導表達將鑒定正確的重組子搖瓶培養，每隔24h添加1%的甲醇作為誘導物，并同時取樣。取40μL粗酶液上清，加入8μL6×SDS-PAGE上樣緩沖液，于100℃煮沸10min，通過SDS-PAGE檢測表達。結果顯示重組羧肽酶蛋白分子量與理論值(58.8kDa)相符(圖2)。通過蛋白質定量分析表明，誘導72h后總蛋白量可達到最大值0.1mg/mL，酶活力測定顯示酵母發酵上清的酶活性為11.6U/mg，從第72h開始，總蛋白開始出現部分降解。

2.3羧肽酶Taq的純化及活性測定洗脫成分經SDS-PAGE檢測顯示300mmol/L咪唑的PBS洗脫效果最好(圖3)。粗酶液超濾后的酶活性為59.4U/mg，親和層析純化完的酶活性為77.6U/mg(圖4)。經軟件預測該蛋白不含潛在的糖基化位點，通過EndoH(29kDa)去糖基化處理該酶，也表明該蛋白沒有被明顯的糖基化(圖5)。

2.4酶學性質分析酶活測定顯示，在50mmol/LTris-HCl(pH7.5)中，最適作用溫度為75℃(圖6A)，在50mmol/L不同pH的反應緩沖液中，其最適作用pH為7.5(圖6B)。

3討論

動物來源的羧肽酶基因經常帶有前肽編碼序列[13-14]，異源表達都以酶原的形式存在，應用的前提是體外激活[1]，這種非特異性激活往往不能賦予酶完整的活性[15]，給應用帶來障礙。國外羧肽酶Taq之前僅有在大腸桿菌中表達的報道,純化極其繁瑣，工業應用前景不強。本實驗通過密碼子優化，使羧肽酶Taq可以在畢赤酵母中有效大量地分泌表達。和傳統的羧肽酶相比，羧肽酶Taq分泌出酵母細胞外時，以成熟的形式存在，且具備高活性80U/mg。并且純化過程只需兩步操作，就可以獲得大量的高酶活羧肽酶Taq，這是大規模制備和生產羧肽酶Taq的基礎。酶學性質實驗發現，組氨酸標簽融合的羧肽酶Taq最適pH和溫度與天然的酶有一定差別。天然酶的最適pH為8.0，最適溫度為80℃，本實驗研究組氨酸標簽融合重組酶的最適pH為7.5左右，最適溫度為75℃，在70℃以上，該酶保持較高活性。產生該差異的機制目前并不清楚，畢赤酵母表達的分泌蛋白往往容易發生N-糖基化，N-糖基化往往可以改變酶的某些生物學活性[16]，通過去N-糖基化處理發現畢赤酵母表達的羧肽酶Taq不帶有N-糖基化，然而是否是組氨酸標簽影響了羧肽酶Taq最適作用pH和溫度仍然有待研究。由于羧肽酶水解能力差，作用底物范圍小，羧肽酶極少應用于工業生產。而本研究中的重組羧肽酶Taq具有高酶活和廣泛的底物特異性等特點，有大規模應用于工業酶法水解多肽的前景，但是該酵母工程菌在小肽水解方面的工業應用值得我們更深入的探索。

作者：余先紅汪曉娟鐘星唐微翟超陳晚蘋馬立新單位：湖北大學生命科學學院湖北省工業生物技術重點實驗室生物資源綠色轉化湖北省協同創新中心湖北大學知行學院生物工程系