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《生物工程學(xué)報(bào)雜志》2014年第六期
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種和質(zhì)粒大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；宿主菌畢赤酵母GS115、質(zhì)粒pPICZαA購自Invitrogen公司。
1.1.2試劑及儀器擬南芥ArabidopsisthalianacDNA為山東大學(xué)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室所贈(zèng)；Taq酶、DNA連接酶、限制酶均購自大連寶生物公司；DNA柱純化試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司；DNA及蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量、質(zhì)粒提取試劑盒以及T載體購于北京全式金公司；LB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基均按照Invitrogen公司畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)配制；其他試劑為國產(chǎn)和進(jìn)口分析純?cè)噭Ｋ脙x器：2720ThermalCyclerPCR儀；國產(chǎn)DYY-12電泳儀；Bio-RadGenePulserⅡ電轉(zhuǎn)化儀；島津GCMS-QP2010氣質(zhì)聯(lián)用儀。
1.1.3引物據(jù)擬南芥硫酯酶基因AtFatA(GenBank:AK176105)設(shè)計(jì)引物，上游、下游引物分別命名為P1、P2，并分別引入EcoRⅠ、XbaⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)。
1.2方法
1.2.1PCR反應(yīng)獲取目的片段以擬南芥的cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30s；57℃30s；72℃2min；30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物并進(jìn)行柱回收。
1.2.2構(gòu)建重組T載體pEASY-Blunt-AtFatA將T載體及上述PCR反應(yīng)所得基因產(chǎn)物分別進(jìn)行EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切反應(yīng)，膠回收基因片段和相同酶切的T載體，按照一定比例連接得到重組T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并將其涂布于含有30µg/mLZeocin抗性平板，37℃恒溫箱隔夜培養(yǎng)，藍(lán)白斑篩選，用滅菌牙簽挑取抗性單克隆菌落，分別以P1、P2作上、下游引物，進(jìn)行菌落PCR初步驗(yàn)證。 按對(duì)應(yīng)序號(hào)在同濃度Zeocin抗性低鹽LB培養(yǎng)基中擴(kuò)培，提取重組T載體，酶切二次鑒定，然后將通過驗(yàn)證的重組T載體送至上海生工測(cè)序最終驗(yàn)證。
1.2.3重組質(zhì)粒pPICZαA-AtFatA的構(gòu)建搖菌并提取、純化重組T載體、pPICZaA質(zhì)粒，對(duì)二者分別進(jìn)行EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切反應(yīng)，膠回收AtFatA基因片段和相同酶切的pPICZαA質(zhì)粒，按照一定比例連接得到重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(圖1)，然后按照1.2.2中重組T載體的操作方法對(duì)其進(jìn)行抗性篩選；37℃隔夜培養(yǎng)后見白色菌落。進(jìn)一步對(duì)所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPICZαA-AtFatA進(jìn)行如上重組T載體的三步驗(yàn)證，確保重組質(zhì)粒構(gòu)建成功以及所攜目的基因的精確。
1.2.4重組質(zhì)粒pPICZαA-AtFatA的轉(zhuǎn)化和鑒定將提純的pPICZαA-AtFatA質(zhì)粒用SacⅠ限制酶單切線性化后，電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有120µg/mLZeocin的YPDS平板，30℃培養(yǎng)4−6d，篩選到陽性轉(zhuǎn)化子。同濃度ZeocinYPD培養(yǎng)基擴(kuò)培后提取重組菌的基因組，以P1和P2為引物進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)以轉(zhuǎn)化過空載體的菌株作空白對(duì)照。
1.2.5外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)挑取Mut+重組子，接種至含50mLBMGY培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃、250r/min振蕩培養(yǎng)20h；3000r/min離心5min，棄去上清，再以50mLBMMY重懸菌體；菌液置于500mL擋板瓶中，用四層紗布封口，28.5℃、250r/min振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)；每24h向培養(yǎng)基中添加除菌的無水甲醇使其終濃度為0.5%，誘導(dǎo)72h，收集發(fā)酵物。取少量發(fā)酵產(chǎn)物離心，收集發(fā)酵上清液與發(fā)酵既得菌體。在緩沖液保護(hù)下將菌體破壁、3000r/min離心5min處理，保留上清。同時(shí)取野生菌進(jìn)行相同發(fā)酵條件及后期處理，以作空白對(duì)照。用SDS-PAGE法分別對(duì)發(fā)酵上清液和破壁離心后菌體上清液進(jìn)行蛋白檢測(cè)。
1.2.6胞外游離脂肪酸的檢測(cè)用氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)檢測(cè)胞外游離脂肪酸種類及含量，進(jìn)而間接評(píng)估外源硫酯酶蛋白活性。將1.2.5中的發(fā)酵上清液進(jìn)行脂肪酸甲酯化處理，處理方法參考文獻(xiàn)[17]。GC-MS色譜條件：毛細(xì)管柱為DB-5MS，載氣為高純氦氣(99.999%)，進(jìn)樣器溫度230℃，檢測(cè)器溫度250℃，載氣柱頭壓65.2kPa。程序升溫條件：初始溫度90℃，保持3.5min，5℃/min升至250℃，保持5min。分流比設(shè)定為1：30，每次進(jìn)樣量為1μL。
2結(jié)果與分析
2.1目的基因擴(kuò)增以擬南芥的cDNA作為模板，由PCR擴(kuò)增得到約1200bp的目的片段，大小與擬南芥硫酯酶基因預(yù)測(cè)值相符，說明目的基因克隆成功。
2.2重組T載體及重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定硫酯酶基因擴(kuò)增片段插入T載體、重組質(zhì)粒。經(jīng)菌落PCR及對(duì)提取重組T載體、重組質(zhì)粒分別酶切驗(yàn)證(重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證如圖2所示)，硫酯酶目標(biāo)片段經(jīng)DNA測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果與GenBank(AccessionNo.AK176105)序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增所得基因片段序列與擬南芥FatA型脂酰-ACP硫酯酶目的基因序列相似度達(dá)到100%，未發(fā)生堿基突變或丟失，表明目標(biāo)基因(AtFatA)擴(kuò)增獲得成功。
2.3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化將構(gòu)建完成并測(cè)序無誤的重組質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化法整合到畢赤酵母GS115基因組中，從抗性平板上挑取陽性菌落，經(jīng)YPD液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)48h，提取酵母基因組，以P1，P2為引物進(jìn)行PCR鑒定，證明陽性轉(zhuǎn)化子基因組為模板成功克隆出AtFatA基因，重組質(zhì)粒整合進(jìn)入畢赤酵母基因組，重組菌構(gòu)建成功，命名為Pichiapastoris-AtFatA。digestionofrecombinantplasmidpPICZαA-AtFatA.
2.4外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與對(duì)照菌相比，整合有擬南芥硫酯酶基因的重組菌在陽性轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)胞外蛋白檢測(cè)，并未發(fā)現(xiàn)差異蛋白；但對(duì)胞內(nèi)蛋白進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)重組菌多出一條大小約45kDa的蛋白(圖3中6、8泳道所示)，這與擬南芥硫酯酶預(yù)測(cè)的相對(duì)分子質(zhì)量大小相符。這說明重組菌株表達(dá)的外源蛋白成功，但是并沒有直接將外源蛋白分泌至胞外，而是以胞內(nèi)蛋白形式存在。比對(duì)胞內(nèi)外蛋白電泳圖，分析認(rèn)為目的蛋白沒有分泌至胞外的原因可能有以下兩點(diǎn)：一是目的蛋白分泌到胞外后被胞外的蛋白酶所降解。從圖3的1−4泳道中可以看到胞外確實(shí)存在微量非目的蛋白(約38kDa處)的蛋白條帶，說明了蛋白酶存在的可能性。相同條件下重新?lián)u瓶發(fā)酵，發(fā)酵液中添加蛋白酶抑制劑以作對(duì)照。發(fā)酵結(jié)束后取對(duì)照組發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)仍得到完全一致的結(jié)果，未見目的蛋白條帶，這說明1−4泳道中的微量蛋白并非蛋白酶，排除蛋白酶干擾的可能性；二是目的蛋白沒有按照預(yù)期設(shè)計(jì)分泌到胞外，而是以胞內(nèi)蛋白的形式存在。由于目的蛋白的分泌受外源基因的特性如基因密碼子組成，信號(hào)肽的準(zhǔn)確表達(dá)與引導(dǎo)，目的蛋白分泌前在胞內(nèi)相關(guān)細(xì)胞器上的正確修飾與傳送以及該目的蛋白本身的空間結(jié)構(gòu)等多種因素影響，上述任一因素的干擾都可能會(huì)最終導(dǎo)致目的蛋白的分泌失敗[18-20]。
2.5胞外游離脂肪酸的檢測(cè)分別收集野生菌及重組菌的發(fā)酵上清液，對(duì)胞外游離脂肪酸進(jìn)行甲酯化處理，并分別對(duì)兩組甲酯化產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，結(jié)果如圖4、5所示。分析對(duì)比該兩組相同檢測(cè)條件下的圖譜可知，重組菌與對(duì)照菌均主要含6種胞外游離脂肪酸，分別為辛酸(8：0)、月桂酸(12：0)、肉豆蔻酸(14：0)、棕櫚酸(16：0)、油酸(18：1)、硬脂酸(18：0)，這說明重組菌中AtFatA基因的表達(dá)并沒有改變菌體產(chǎn)生胞外游離脂肪酸的種類。與野生菌相比，重組菌Pichiapastoris-AtFatA生產(chǎn)胞外游離辛酸、月桂酸、豆蔻酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸的能力分別為野生菌的151%、110%、85.5%、68.2%、62.7%和75%。重組菌比野生菌胞外游離MCFAs(主要是辛酸)產(chǎn)量增加51%，MCFAs產(chǎn)量在胞外總游離脂肪酸產(chǎn)量中所占比例達(dá)到28.7%，高出野生菌10.6%。
3討論
實(shí)驗(yàn)在宿主菌畢赤酵母GS115的基因組上插入外源AtFatA基因?qū)ζ溥M(jìn)行基因改造并成功表達(dá)，大幅度提高了胞外游離MCFAs的產(chǎn)量，使得直接從發(fā)酵液中方便地分離提取MCFAs成為可能，免去了破碎細(xì)胞提取發(fā)酵產(chǎn)物的繁瑣，節(jié)約生產(chǎn)成本，利于工業(yè)化生產(chǎn)。與外源硫酯酶的植物表達(dá)系統(tǒng)[21]相比，該表達(dá)系統(tǒng)的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化及高密度發(fā)酵等操作接近原核生物，表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)單[16]，非常適合規(guī)模化生產(chǎn)；而與該外源酶的原核表達(dá)系統(tǒng)[22]相比，該真核表達(dá)系統(tǒng)則具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加工能力，有利于真核蛋白的表達(dá)[16]，且該系統(tǒng)不產(chǎn)生內(nèi)毒素，更適和用于食品及醫(yī)藥品的生產(chǎn)。值得一提的是外源AtFatA基因是以基因重組的方式整合到畢赤酵母的基因組上，故而外源基因在畢赤酵母中比較穩(wěn)定，不會(huì)發(fā)生原核表達(dá)系統(tǒng)傳代過程中類似質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象[23]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有穩(wěn)定、低毒、代謝可控以及適和規(guī)模發(fā)酵等諸多優(yōu)點(diǎn)，該研究方法對(duì)指導(dǎo)生產(chǎn)食品及藥用MCFAs具有一定的積極意義。但我們認(rèn)為要想將此技術(shù)運(yùn)用到工業(yè)生產(chǎn)上還存在以下兩個(gè)問題：第一，該實(shí)驗(yàn)只是通過搖瓶發(fā)酵的方式對(duì)該重組菌產(chǎn)MCFAs的性能進(jìn)行了檢測(cè)，其生產(chǎn)MCFAs的能力雖較野生菌有一定程度提高，但要想進(jìn)一步提高其產(chǎn)量，擴(kuò)大到工業(yè)化生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)規(guī)模發(fā)酵還需摸索諸多條件，如該重組菌在發(fā)酵罐中產(chǎn)MCFAs的最適溫度、pH、及供氧量乃至最適發(fā)酵周期等，這些因素都將對(duì)發(fā)酵效率產(chǎn)生影響[24-26]；第二，如何從發(fā)酵液中安全、穩(wěn)定、方便地分離或提取MCFAs的工藝尚需進(jìn)一步摸索。在此分離或提取過程中應(yīng)盡量不引入對(duì)人體有毒害作用的提取劑，從而確保生產(chǎn)出的MCFAs在食品及藥用等方面的安全性，又可減少產(chǎn)物后期處理中為除去引入的有毒提取劑而徒增的工藝流程，節(jié)約生產(chǎn)成本。相信隨著對(duì)巴斯德畢赤酵母研究和認(rèn)識(shí)的進(jìn)一步深入以及化工行業(yè)分離提取技術(shù)的蓬勃發(fā)展，上述的兩個(gè)問題短期內(nèi)即可得到解決，屆時(shí)利用工程菌的代謝生產(chǎn)MCFAs亦會(huì)具有一定的應(yīng)用前景。
作者：郝昭程王騰飛李忠奎郝梓凱戴琨王瑞明單位：齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院