酵母分泌系統改造策略及優點范文

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工程化改造方法往往先考慮宿主的篩選和啟動子/信號肽的優化，通過改造一般會使蛋白質分泌水平提高3～10倍。然而即使當蛋白質轉錄、翻譯水平以及宿主均達到最優水平時，許多蛋白質的表達量仍然相對較低，這表明外源蛋白分泌不僅僅是一個蛋白質合成的過程，還涉及很多復雜的調控過程，涉及初生蛋白的共轉錄及轉錄后的內質網定位、內質網內的蛋白質折疊及監控、內質網及高爾基體內的翻譯后糖基化修飾、胞內蛋白的轉運和分選及蛋白酶降解等過程，因此通過遺傳修飾對宿主菌的工程化改造成為提高蛋白質表達量的最有效的手段。隨著后基因組技術的發展和系統生物學方法的應用，菌株工程化改造研究得到了極大的發展［6］。本文主要從內質網內蛋白質折疊及監控過程和胞內蛋白運輸途徑的角度綜述酵母分泌系統工程化改造的研究進展。

1內質網內蛋白折疊及監控過程的工程化改造

1．1蛋白質胞內分泌過程

蛋白質的胞內分泌過程起始于通過SEC61易位子向內質網的共轉錄或轉錄后轉運過程，進而在內質網內折疊形成天然結構，此過程受到嚴格的監視調控［7～10］。初生蛋白進入內質網后，與kar2基因編碼的分子伴侶結合蛋白BiP相結合折疊成天然結構，同時與cnei基因編碼的鈣連接蛋白結合輔助其正確折疊并進行N-糖基化加工，此外在內質網內還可進行一系列共價修飾，包括信號肽加工、二硫鍵形成、N-糖基化、蛋白降解及分選等。經折疊及修飾加工后，只有正確折疊組裝的蛋白可以從內質網轉運入高爾基體，在高爾基體中經進一步修飾加工后被轉運到胞外、液泡或其他細胞器，而發生錯誤折疊或形成多聚體的蛋白質則會被內質網監控系統識別，并與BiP復合物結合進而進入胞質中被降解，此過程被稱為內質網相關的蛋白質降解(ERAD)［11］。一部分錯誤折疊的蛋白質與BiP的結合更為持久，會誘發非折疊蛋白反應(UPR)［12］，促進內質網相關的蛋白質水解過程，并抑制蛋白質的轉錄和轉運過程。

1．2內質網蛋白質折疊監控體系構成

內質網駐留蛋白質折疊和監控體系主要包括五類要素:輔助蛋白質折疊的分子伴侶(如BiP、鈣連蛋白和鈣網蛋白等)、輔助蛋白質形成正確構象的酶(如二硫鍵異構酶PDI)、ERAD相關蛋白降解機制、UPR相關信號通路和參與翻譯后修飾的酶。

1．3工程化改造

由于存在復雜嚴格的監控體系，蛋白質折疊往往成為外源蛋白分泌最主要的限速瓶頸，而折疊和監控體系也成為菌株工程化改造的主要對象。內質網蛋白質折疊和監控系統的復雜性和嚴格性與很多基因相關，對其進行遺傳修飾比較困難。因此一種更為直接有效的方法是過表達多種分子伴侶、二硫鍵異構酶及其他輔助折疊因子。已有研究表明，過表達一種Hsp70家族的分子伴侶BiP可以促進外源蛋白在釀酒酵母中的分泌，人紅細胞生成素的表達量可提高5倍［13］，牛凝乳酶的表達理論上可提高26倍［14］;而降低BiP的水平會導致外源蛋白分泌水平下降［15］。但分子伴侶對蛋白質分泌的影響并非適用于所有情況，具有蛋白質或宿主特異性，有些研究也發現過表達分子伴侶對蛋白質的分泌有負面的影響。如多形漢遜酵母過表達BiP使黑曲霉葡萄糖氧化酶的胞外表達水平降低了10倍［16］，可能的解釋是，由于分子伴侶系統存在級聯效應，Bip過表達可能會阻抑其他分子伴侶的作用，另外過表達也會增加其與靶蛋白持久結合的可能性，從而促進了內質網相關的蛋白質水解過程而非蛋白分泌過程。其他一些輔助因子也對蛋白分泌具有調控作用。共伴侶分子DNAJ及其他因子(如SLS1/SIL1和LHS1)可以調控BiP的ATP酶活性，影響其參與的多種功能，包括易位子門控、初生蛋白折疊、錯誤折疊蛋白靶向降解、非折疊蛋白反應調控和內質網鈣儲存等。在釀酒酵母中，過表達單一或多種共伴侶分子，如JEM1(一種DNAJ同源蛋白)、SIL1、LHS1和SCJ1，可以顯著提高重組人白蛋白rHA、重組人轉鐵蛋白rTf及GM-CSF的表達量［17］。二硫鍵異構酶PDI和巰基氧化酶等對于蛋二硫鍵的形成具有重要作用，過表達PDI可以提高某些蛋白的分泌水平［18］，同時過表達PDI和分子伴侶蛋白對于轉鐵蛋白的分泌表達提高具有協同效應［19］。在粟酒裂殖酵母中，提高兩種PDI的水平可以顯著提高轉鐵蛋白的分泌水平［20］，增加PDI和聚泛素蛋白基因水平也可以極大提高人血白蛋白的表達水平，但對IL-1β的表達沒有影響［21］。另一種促進分泌的方法是調節UPR信號通路調節蛋白Hac1。非折疊或錯誤折疊蛋白在內質網中發生累積，通過HAC1誘發非折疊蛋白反應，從而激活分子伴侶表達并抑制目的蛋白的分泌。釀酒酵母過表達里氏木霉hac1基因時，芽胞桿菌α-淀粉酶的分泌量提高了2．4倍［22］;釀酒酵母hac1基因過表達可使內源轉化酶分泌量提高2倍，重組α-淀粉酶產量提高70%［22］;過表達hac1選擇性剪接形式(hac1i)可以提高3種重組蛋白的分泌［17］。然而令人意外的是，過表達共分子伴侶(sil1，lhs1，jem1和scj1)反而會使hac1i轉錄水平降低2倍，hac1表達的破壞會使α-淀粉酶和內切葡聚糖酶EGI的分泌分別減少75%和50%，但對內源轉化酶分泌量沒有影響［22］。這些結果表明，hac1過表達對分泌的影響具有蛋白質或宿主特異性，而且HAC1蛋白與其他分子伴侶之間存在復雜的調控關系。

2胞內蛋白質運輸通路的工程化改造

2．1蛋白質胞內運輸過程

蛋白質胞內轉運過程包括初始共翻譯、翻譯后轉位入內質網內腔，以及隨后逐步膜泡運輸過程(內質網向高爾基體、高爾基體內部、后高爾基體轉運)。蛋白質在內質網中正確折疊后主要通過包膜運輸小泡進行選擇性運輸，因此胞內蛋白質運輸一般稱為膜泡運輸或膜運輸。新合成的蛋白質往往被有選擇地濃縮到不同的膜泡群體中，進而靶向不同的受體，稱為蛋白靶向或蛋白質分選。分泌運輸早期從胞質向內質網的轉運是蛋白質運輸通路中不可忽視的重要環節。在酵母中，存在兩條由胞質向內質網的靶向轉運途徑:共翻譯轉運途徑和翻譯后轉運途徑。信號肽對于蛋白質的靶向轉運是必須的，其由一段長度為15～50個氨基酸的片段組成，通常有一個疏水核心、一段帶正電的N端及一段親水的C端。在共翻譯轉運途徑中，一旦信號肽N端暴露出來，核糖體－新生蛋白鏈復合物會通過信號識別顆粒(SRP)和其受體(SR)被轉運到內質網上的易位子通道;而酵母分泌蛋白主要選擇翻譯后轉運途徑，這是由于這些蛋白質的信號肽疏水性不強，合成時逃脫了SRP的識別，這些蛋白質從核糖體上釋放出來后被胞質分子伴侶及共伴侶識別，以維持其非折疊或松散折疊的狀態，直到通過易位子通道，這意味著過表達胞質分子伴侶和核糖體結合因子可能會對蛋白質分泌有一定的作用。

2．2工程化改造

2．2．1信號肽優化早期分泌過程中，蛋白質靶向的特異性主要由分泌信號肽的疏水核心及其與胞質內SRP的相互作用所決定，因此對應每一種宿主系統都開發了多種類型的N端分泌信號肽和酵母特異的前導氨基酸序列，信號肽剪切位點在內質網和高爾基體中被一步一步加工處理，以確保目的蛋白從胞質經內質網到高爾基體的正確轉運。源于酵母信號肽的應用可以提高外源蛋白的分泌水平。源于釀酒酵母的前導信號肽α因子包含一個連續兩個堿性氨基酸位點，此位點可以被高爾基體中的內切蛋白酶識別，應用此信號肽可以獲得對外源蛋白的高效分泌表達。釀酒酵母信號肽MFα可以提高纖維素酶Eg1和血管內皮生長因子在酵母中的分泌水平［23，24］。在釀酒酵母和畢赤酵母中，應用綠色熒光蛋白和其他異源蛋白作為報道蛋白對不同的信號肽序列進行比較發現，α因子更適用于外源蛋白的分泌表達［25，26］。Liang等［27］通過分析酵母內源性蛋白的信號肽，發現了3種可能的分泌信號序列，這些信號序列與α因子一樣，可以促使綠色熒光蛋白和其他異源蛋白有效的分泌。其他來源的信號肽有些也適用于酵母系統，例如應用里氏木霉自身疏水蛋白HFBI和HFBII序列作為分泌信號可以獲得較高水平綠色熒光蛋白的分泌［28］。對某些無法有效進入內質網的蛋白質，優化信號肽序列是最有效的提高分泌水平的方法。然而有些時候信號肽的優化也無法有效地引導靶蛋白進入內質網，研究表明除N端信號肽外，信號錨定序列的性質也對蛋白質的運輸方式具有決定作用，因此將目的蛋白與某些其他蛋白、亞結構域、標簽蛋白或信號錨定肽進行融合表達也有利于蛋白質分泌。

2．2．2運輸通路改造胞內運輸每個步驟中膜泡的正確靶向都受許多胞內膜蛋白的控制，并決定最終的整體分泌水平，因此當存在運輸效率低或分選錯誤的情況時，對于運輸通路的遺傳優化是最先考慮的改造方式。有些情況下，盡管蛋白質已經進入內質網并進行正確折疊后也無法從胞內分泌出來，這表明在從內質網到高爾基體或后高爾基體運輸過程中還存在其他的限制因素。這兩個過程涉及大量膜蛋白，其中一部分功能還不明確，因此明確蛋白在胞內運輸過程中的限制環節是工程化改造的首要步驟。有研究發現當人生長激素在裂殖酵母中進行表達時，有部分激素蛋白滯留于胞內，這主要由從高爾基體到液泡的錯誤分選造成。液泡蛋白分選受體VPS10在這一分選過程中起主要作用，VPS10也是液泡羧肽酶CPY的受體，所以其介導的液泡分選途徑也被稱為CPY途徑。在晚高爾基體中，液泡定位的各種酶主要通過結合Vps10從而與分泌蛋白分離，這表明存在VPS10介導的錯誤分選使分泌蛋白積累于液泡中的可能。在酵母中也有類似的報道，vps10基因缺失對于某些外源蛋白的分泌有正面影響［29］，而對于胰島素融合蛋白沒有效果，而缺失其他五種vps基因(vps4、vps8、vps13、vps35和vps36)卻可以提高其分泌水平。這表明除VPS10途徑外還存在其他的液泡分選途徑，如需要接頭蛋白AP3和VPS41參與的堿性磷酸酶(ALP)途徑等，可見液泡分選途徑也具有蛋白質特異性，對其進行遺傳修飾還需要對相關基因功能有進一步的系統研究。盡管運輸過程進行遺傳修飾已經成為一種可能的宿主工程化方式，但目前還難以通過修飾一個或少數幾個基因來達到對蛋白運輸的完全控制，而且這種修飾常會影響細胞的活性。

2．2．3融合表達對于某些難以進入分泌途徑的融合蛋白，往往可以通過融合標簽或其他促分泌蛋白來進行改善。Ahn等［30］報道通過在N端融合一段來自于哈茨木霉內切葡聚糖酶Ⅱ的細胞膜結合結構域(CBD)，可以使嗜熱脂肪芽胞桿菌脂肪酶L1在釀酒酵母中的分泌量提高7倍，在高密度發酵條件下分泌表達水平達到1．3g/L;進一步發現在CBD和L1之間插入一個Kex2酶切位點仍然表現出相同的提高水平，由于此酶切位點在高爾基體中被識別剪切，因此推測CBD結構域主要在從內質網到高爾基體轉運的過程中起作用。此外在釀酒酵母中融合表達類芽胞桿菌纖維素酶和細胞壁蛋白Pir4的不同結構域，也實現了該蛋白在釀酒酵母中的成功表達［31］。因此當菌株或靶蛋白改造難以起效時，融合表達也是一種有效的改善蛋白質分泌水平的手段。

3展望

在已經發展成熟的酵母表達載體和發酵工藝基礎上，對蛋白質分泌途徑的系統化修飾已經成為一種常用的酵母分泌體系改造策略。基因組技術的快速發展將會為酵母體系的進一步改造提供新的更為系統化的信息和解決方案。可以期待的是，經過進一步優化的酵母體系必將會為藥用蛋白的工業化生產帶來重大突破。

作者：常亮劉曉志孟雅娟馬志珺高健單位：華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司抗體藥物研制國家重點實驗室